广西地方标准《H10N8亚型禽流感病毒检测 多重反转录聚合酶链（RT-PCR）检测法》（征求意见稿）.doc

ICS11.220 B 41 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T XXXXX—2016 H10N8亚型禽流感病毒检测 多重反转录聚合酶链检测法 Detection of H10N8 subtype Avian Influenza Virus by Multiple Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Method 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 （本稿完成日期：2015年11月20日） 2016 - XX - XX发布 2016 - XX - XX实施 广西壮族自治区质量技术监督局发布 前言 本标准。H10N8亚型禽流感病毒检测 多重反转录聚合酶链检测法 范围 本标准规定了多重反转录聚合酶链反应法检测的H10N8亚型禽流感病毒的术语和定义、材料与试剂、仪器设备和消耗品、操作方法、结果判定及废弃物的处理。 本标准适用于H10N8亚型禽流感病毒的检测。 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。Mg2+存在的条件下，依赖于Taq DNA聚合酶的酶促反应。又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，简称PCR技术。 引物primer(p) 指分别与待扩增DNA片段两侧互补的一小段(约20 bp)寡核苷酸。 特异性引物specific primer(SP) 针对特定DNA片段在其两侧设计合成的一小段互补寡核苷酸，在PCR反应中与DNA模板特异性结合。它决定了PCR扩增产物的特异性。 多重RT-PCR反应 reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) 是一种特殊RT-PCR形式，其最突出特点，通常是指在同一反应体系中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域，即一次PCR反应，可同时检测、鉴别出多种病原体。 材料与试剂 H10N8亚型AIV特异性引物 根据H10N8亚型AIV HA基因和和NA基因序列，分别设计了用于扩增HA和NA基因的两对特异性引物HA1、HA2和NA1、NA2。引物HA1和HA2扩增HA目的片段大小为267 bp，引物NA1和NA2扩增NA目的片段大小为464 bp，引物的使用浓度为μmol/L。根据附录A中A.1.1给出的引物寡核苷酸序列送测序公司合成。使用前先用灭菌双蒸水稀释，置－20 ℃保存备用，避免反复冻融。 试剂 RNA抽提试剂 RNA 抽提试剂如下： Trizol RNA抽提试剂； 氯仿； 异丙醇； 75℅乙醇（DEPC水配制）。 Trizol? RNA抽提试剂（商品名）是由Invitrogen公司（供应商）提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其它等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 RT-PCR试剂盒 RT-PCR试剂盒如下： Taq DNA聚合酶； 反转录酶； RNA酶抑制剂； 随机引物； dNTPs 混合物：dATP、dTTP、dCTP、dGTPPCR缓冲液（含Mg2+）。 试剂盒包含了RNA反转录以及PCR扩增所必需的各种酶、dNTPs及Mg2+等全部试剂。可向多个生物工程公司购得，使用时按本标准给出的量使用。 电泳试剂 电泳试剂如下： 1℅琼脂糖溶液； 10 mg/mL GoldView染料； 加样缓冲液； 1倍TAE电泳缓冲液。 其他试剂 其他试剂如下： 灭菌双蒸水； 磷酸盐缓冲液（PBS pH7.2)； DEPC水PCR仪； 电泳仪； 紫外检测仪； 凝胶成像系统； 小型高速离心机； 旋涡振荡器； 研钵或玻璃研磨器； 微量加样器； 超净工作台; 手套； 离心管； PCR反应管； 吸头。 操作方法 注意事项 整个操作应在一个无RNA酶污染的环境下进行，所以整个操作过程宜在超净工作台中进行，戴口罩并使用一次性手套。 玻璃器皿常规洗净后，用终浓度为0.1％ DEPC水2 h。倒去浸泡的DEPC水1.034×105 Pa 高压灭菌30 min，经50 ℃烘烤4 h 以上或100 ℃ 干烤15 min。 离心管、PCR反应管、微量加样吸头应使用一次性无RNA酶的塑料制品，使用前经1.034×105 Pa 高压灭菌30 min。所有参与反转录的溶液用DEPC处理过的水配制。 DEPC水的制备见附录B中B.4。 样品的准备 样品的采集和预处理 粪便和口鼻分泌物 用棉拭子采取待检家禽或野鸟的粪便、口鼻分泌物，经含有青、链霉素（各10000单位/mL)的PBS溶液稀释，650 g离心10 min，取上清250 μL供总RNA抽提或置－70 ℃ 保存备用。 病料组织 取患病家禽或野鸟的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏和气管样品约各1g，置于研钵或玻璃研磨器中，加入适量的含