广西地方标准《H6亚型禽流感病毒的检测 荧光定量RT-PCR反应法》（征求意见稿）.doc

ICS11.220 B 41 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T XXXXX—2016 H6亚型禽流感的检测 荧光定量反转录聚合酶链反应法 Real-time fluorescent quantitative RT-PCR for detection of H6 subtype avian influenza virus 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 （本稿完成日期：：2016年1月20日） 2016 - XX - XX发布 2016 - XX - XX实施 广西壮族自治区质量技术监督局发布 目次 前言 II 1　范围 1 2　术语和定义 1 2.4 1 3　材料准备 1 3.1　试剂 1 3.2　仪器设备及耗材 2 4　操作方法 2 4.1　操作环境 2 4.2　待检样品处理 2 4.3　待检样品总RNA提取 2 4.4　荧光RT-PCR反应 2 4.5　阳性对照及阴性对照 3 5　结果判定 3 5.1　结果分析条件设定 3 5.2　质控标准 3 5.3　结果描述及判定 3 附录A（规范性附录）　 4 附录B（规范性附录）　 5 前言 本标准。 H6亚型禽流感的检测 荧光定量反转录聚合酶链反应法 范围 本标准规定了采用荧光定量反转录聚合酶链反应法检测 H6 亚型禽流感病毒的材料准备、操作方法及结果判定。 本标准适用于 H6 亚型禽流感病毒的检测。 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 禽流感病毒（AIV）Avian Influenza virus 感染禽类为主的流感病毒，属于，单股链 RNAAvian Influenza virus 禽流感病毒根据血凝素 ( HA )的不同，可以分为 16 个 HA 亚型，H6 亚型禽流感病毒是其中的一种。 反转录 reverse transcription 以 RNA 为模板合成 cDNA 的过程。 荧光定量聚合酶链反应 real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction 是PCR技术的一种特殊形式。指在反应体系中加入特异性的引物和含有荧光基团的探针以扩增特定模板的PCR技术，同时利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 ml 离心管中，加入灭菌的 1 mol/L PBS（pH 7.2）1 ml，用组织匀浆机充分研磨后，反复冻融 3 次，以 10 000 ×g 离心 5 min；棉拭子样品直接加入 1 mL PBS（ pH 7.2），振荡混匀，以 10 000 ×g 离心 1 min；取样品上清，用于总 RNA 抽提。 待检样品总RNA提取 取(200 μL待检样品上清置于无 RNA 酶的(1.5(mL 离心管中，按照 RNA 提取试剂盒操作说明书抽提总 RNA。总 RNA 可直接作为模板进行反转录，或置 -20(℃(保存备用。 荧光RT-PCR反应 反应液总量(20(μL。在冰浴条件下，在 荧光 PCR 反应管中按下列用量分别加入各成分： 2 × One Step RT-PCR Buffer Ⅲ：10 μL ； Ex Taq HS （5 U/μL）：0.4 μL ； PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ：0.4 μL ； H6F引物：0.4 μL ； H6R引物：0.4 μL ； Probe H6探针：0.8 μL ； ROX Reference Dye II（用AB公司仪器需用）：0.4 μL ； 待检总 RNA 模板：5 μL； 灭菌双蒸水：补足总体积至20 μL。 加完试剂后瞬时离心混匀，将荧光 PCR 反应管置于荧光定量 PCR 仪内，按如下程序进行反应：第一阶段预变性 42 ℃ 5 min， 95 ℃ 10 s ；第二阶段 95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s ，共 40 个循环；荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。 阳性对照及阴性对照 阳性对照 使用 H6 亚型禽流感病毒 H6-192 质粒作为阳性对照标准品。用核酸蛋白分析仪测定其光吸收值( OD260 )后计算浓度，用灭菌双蒸水稀释至 1.0(105 拷贝/μL，作为阳性对照标准品，-20 ℃ 保存备用。 阴性对照 用无 RNA 酶水代替模板作为阴性对照模板。 结果判定 结果分析条件设定 阈值设定根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准。 质控标准 阴性对照 Ct ≥ 37或无Ct 值。 阳性对照 Ct 值均应 ≤ 30，并出现典型的S型扩增曲线。反之，此次检测无效。 结果描述及判定 若被检样品出现H6亚型禽流感病毒的特异性扩增曲线，且Ct 值 ≤ 30，判定为H6亚型禽流感病毒阳性；反