甲基对硫磷降解菌的筛选、鉴定及降解酶基因的定位与克隆研究.pdf

摘要 甲基对硫磷 (methylparathion,MP)是目前我国使用量和生产量最大的农药 品种之一，虽然该农药的使用对农业的发展有重要的作用，但其高毒性对农产 品和环境的安全带来的问题越来越引起人们的重视。利用微生物或微生物源酶 制剂来降解农药是近年来的一个主要努力方向。至今，已经陆续分离到许多甲 基对硫磷降解菌，但是可矿化甲基对硫磷的菌株却很少。我们从山东高密市受 有机磷农药长期污染的土样中分离出多株甲基对硫磷降解菌株，其中之一可能 具有彻底降解甲基对硫磷的能力。 该菌经形态、生理生化特性分析和16SrRNA基因序列同源性分析，鉴定为 变形细菌a-亚群中的根瘤菌科苍白杆菌属 (Ochrobactrumsp.)，命名为B2oB2 在pH8-9,温度30℃左右生长良好，能以甲基对硫磷为唯一碳源或磷源生长。 菌株B2表现对氨节青霉素、链霉素、卡那霉素的抗性，但对利富霉素、氯霉素 敏感。 采用TLC,UV,GC-MS的方法分析了菌株B2降解甲基对硫磷的中间产物， 结果表明B2水解甲基对硫磷产生对硝基苯酚 (PNP),PNP的进一步代谢通过产 生 4-硝基邻苯二酚 (4-nitrocatechol,4-NC)fll1,2,4一三轻基苯 (1,2,4-trihydroxybenzene)(1`J途径。采用气相色谱法测定菌株B2对qt基对硫磷的 降解率，在起始菌的OD,为0.02时，B2在3hrs内Iij.将100mg/I的甲基对硫 磷降解99.2%a菌株B2可以以PNP为碳源生长，在48hrs内，将50mg/L的PNI 完全降解;也可以以4-NC为碳源生长，在60hrs内，将30mg/l.4-NC几乎完 全降解。 B2含有一个大于23k6的质粒，经叮咙橙结合高温处理的方法进行质粒消除 时，获得了缺失质粒的变异株，命名为AteAt不含质粒，可以水解MP产生PNP, 但不能进一步降解PNP，表明苍白杆菌B2水解MP的基因位于染色体上，而降 解PNP的基因与质粒有关。用PCR方法检测发现，菌株B2中的有机磷降解酶 基因不是己知的opd基因。通过构建基因组文库，筛选到两个能降解甲基对硫 磷的阳性克隆，己经测出的部分序列与mpd基因表现出较高程度的核昔酸序列 相似性。 关键词 甲基对硫磷 对硝基苯酚 苍白杆菌 16SrRNA生物降解 基因质粒 Isolationandcharacterizationofabacterialstraincapableof degradingmethylparathion BaiWen-qin(EnviromentalBiotechnology) DirectedbyDr.Xing-huiQiu Abstract Methylparathion(MP)isoneofthemostextensivelyusedpesticidesaroundthe world.AlthoughMPplaysanimportantroleinprotectingagriculturalcropsfrom insectpestsandweedsandincontrollingdisease-transmittingvectors,itcauses seriousenvironmentalpollutionproblems.Howtosolvetheproblemhasbecomea publicconcern.Microorganismsortheircell-freeenzymepreparationsappeartohave, atthemoment,themostpromisingapplicationsindegradingtheresidualpesticides. AlthoughmanymicroorganismscapableofdegradingMPhavebeenisolatedin differentlabs,reportsregardingmicrobeswhichcanmineralizeMParerare.Wehave isolatedseveralMP-degradingbacterialstrainsandoneofwhichpresumably mineralizesMP.Inthi