番鸭呼肠孤病毒受体分子量的测定研讨.pdf

874 2004学术年会 效疫苗打下基础。 3．3 由于受抗原在体内表达量的影响往往不能激发机体产生很强的免疫反应，如果反复免疫则容 易引起免疫耐受。因此许多研究都力图寻找理想的佐剂来增强核酸疫苗的免疫效果，如白介素、CpG 基因。VP22基因在a一疱疹病毒亚科各病毒之间具有很高的同源性，都具有蛋白转导的活性，其中 以BVP22基因的蛋白转导活性最强。本实验在构建了PCV2 ORF2自杀性DNA疫苗的同时，构建 强作用。 参考文献(略) 番鸭呼肠孤病毒受体分子量的测定研究。 孙军杰，吴异健，王劭，吴宝成“ 福建农林大学动物科学学院，福建福州350002 摘要：培养番鸭成纤维细胞并接种番鸭呼肠孤病毒(DRV)B3病毒株进行病毒增殖，提纯病毒： 细胞毒接种健康番鸭制备阳性血清；低渗破膜法提纯番鸭红细胞膜蛋白并进行变性电泳，然后采用 肾上腺素水平前三天达到最高峰，而后随时间延长渐渐下降。提示番鸭呼肠孤病毒受体与D一肾上腺 素受体关系密切。 关键词：番鸭；呼肠孤病毒；病毒受体；病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA) 近年来，我国福建、浙江、广东等番鸭养殖地区相继发生了一种以肝脾出现小白点为主要病变 特征的传染病，俗称番鸭肝“白点病”，2001年吴宝成等在国内率先鉴定此病病原为呼肠孤病毒科 正呼肠孤病毒属番鸭呼肠孤病毒…。 番鸭呼肠孤病毒与受体结合是其感染细胞的第一步，受体决定病毒的细胞嗜性。从分子生物学 角度研究病毒受体是研究病毒致病机理的重要部分。本文将采用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA) 对番鸭呼肠孤病毒受体分子量进行大致鉴定，为进一步对受体进行定性研究、弄清病毒分子水平的 致病机理提供依据。 1材料与方法 1．1番鸭成纤维细胞培养 由福建农大动科院鸭场提供13日龄番鸭胚。无菌操作取出胚体剪去头、翅、爪、内脏，剩余胴 体剪碎后加入约4倍量组织块体积的0．25％的胰酶37℃水浴消化15～20分钟，加入生长液，反复吹 打细胞I虱块，上悬液集中放置，分装后在二氧化碳培养箱中37℃培养。显微镜下可见24小时内细 ’福建省自然科学基金重大项目(2002F003) ”通讯作者 2004学术年会 875 胞即可贴壁伸长生长旺盛呈长梭形并密集交错排列。(具体操作及溶液配方参考㈦。) 1-2病毒制备 取生长旺盛细胞无菌操作吸除培养液，加入约01～0．2ml病毒液，摇匀后放八37。C培养箱感作 o5～lh后加入一定量细胞培养维持液，盖塞放回原处继续培养。与对照瓶比较，4天之内会陆续发 现接毒细胞由长梭形变圆缩并融合成多核细胞，细胞丈面积拉网。待病变达50％～80％时收毒，将 度法测得病毒悬液中蛋白浓度为5mg／ml。 1．3血清制备 上清液用于免疫接种5至6月龄的健康公番鸭。琼扩效价达1：8以上即采血制备血清。采集的血样 室温凝固后溢出的抗血清呈淡黄色。吸出、分装、严密封口、低温保存。 1．4红细胞膜制备 以生理盐水洗涤无菌抗凝采集所得成年番鸭血，沉积红细胞以低渗液破膜，1500rpm离心10min， 分钟，中间即为红细胞膜。紫外分光光度法测膜蛋白浓度为29mg／ml。分装后低温保存或直接做成 上样样品低温保存。(具体操作过程参见‘31) 1．5电泳 1．5．1制胶 时停加，轻轻覆盖0．5cm的水层，待水层和分离胶之间出现清晰界面后吸尽水层改加浓缩胶，同时 将梳子插入，待浓缩胶聚合后拔出梳子，上下槽中加入电泳缓冲液备用。 1．5．2上样 取红细胞膜制剂，以5倍浓度的上样缓冲液(含SDS)配制膜蛋白浓度为7．5mg／ml的上样样品液。 混匀后分装，取1管备用。另取一角管标准蛋白(200ug)加稀释至4倍浓度的上样缓冲液500ul， 按50ul，角管分装后取1管备用，其余低温保存。将上述样品分别在100度水浴中煮沸3。5分钟使蛋 白变性。按50LlⅣ孑L用微量加样器沿加样孔壁缓慢加下。 1．5．3电泳 恒流30mA开始电泳，待溴酚兰染料到达凝胶底部时，关闭电源，取出玻璃板，小心移动两玻 璃板之间隔片，轻轻撬开玻璃板，凝胶便贴在其中一块板上。 1．6 转印 1．6．1转移 泡约5min后，装配转移单元。将转印夹层组合放入转印槽中，使PVDF膜紧靠正极，转移池中注 满转移缓