番鸭细小病毒M91G27株病毒结构蛋白VP3编码基因的克隆与鉴定研究.pdf

主鱼童墼壁堡堂皇查塞生坌垒蔓±迭生主受进皇堡塞墨 番鸭细小病毒M91G27株病毒结构蛋白VP3编码 基因的克隆与鉴定 余兵王永坤朱国强严维巍 (扬州大学畜牧兽医学院动物医学系，扬州225009) ■蔓纯化番鸭细小病毒国内毒株(M91G27)病毒尿囊液．通过PcR技术，从病毒DNA中扩增出病毒结构多 I和s日cI位点之间，酶切分析筛选到 肚vP3完整编码基因．将该PcR扩增片段克隆到pucl8质粒载体的Hinc 含1．6Kb基目片段的重组质粒MPl3．进一步对该片段进行序列穗定及用cLoNE软件分析该序列。结果表明，其 与国外已报道毒株棱苷酿序列有98．8％的同源性，氨基酸序列有98．1％的同源性，证明该重组质粒是VP3编码基 因的克隆。 关t调t番鸭阚小病毒聚合酵链反应VP3编码基因／重组质I目r： 番鸭细小病毒(Muscovy 国福建，广州等地先后爆发了一种类似于小鹅瘟的病毒性疾病，称为雏番鸭细小病毒病““1。其后， 国内学者对番鸭细小病毒的部分特性及雏番鸭细小病毒病的诊断与防制进行了研究。～‘，并进行 了番鸭细小病毒与鹅细小病毒(GPv)的比较研究，初步证明了两种病毒在抗原结构上有些差 异：““r。法国学者报道了l989年在法国两个地区爆发雏番鸭细小病毒病，并从发病群中分离到 Nx2和GM两个毒株进行部分特性的研究，认为该病原为一种新的细小病毒，在形态和理化特性 上类似于GPv[“。1995年，匈牙利学者首次报道了MPV和GPV全基固组序列并进行了比较分 折，发现两种病毒的基因组有81．9％的同源性”1。 MPv基因组全长约5．1kb．包括有两个阅读框架LORF与RORF，前者编码翻译非结构蛋白； 后者编码翻译病毒的三种结构蛋白vPl，VP2与VP3，其中VP3为主要结构蛋白，约占病毒衣壳 蛋白的78．5纷“。在国内，MPv对养番鸭业危害极大，但MPV与GPV在抗原性上极为相似，而且 目前国内还没有它们分子水平研究的报道。因此，本实验在王永坤等人对MPV研究的基础上。51， 的部分序列．进行核苷酸及其推导的氨基酸序列分析，来探讨国内MPV与国外MPV在分子水平 上的相关性，为下一步从分子水平上分析MPV与GPV之间的相关性提供了理论基础。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1质粒、菌株、病毒等 TGl由本室保存；MPV毒株M91G27 克隆载体pucl8从蒋国B．M公司购置；受体菌E．coli 由本室提供。 1．1．2生化试剂和分子生物学试剂等 I、Hind DNA连 l、Hinc 限制性内切酶sac I，Ampicillin等购于上海华美生物工程公司T4 Master clean upKit等均购自德国B．M公司；蛋白酶K为 接酶、PcR Kit、x—gaI、lPTG、PcR Merck公司产品。 一l91— 主星董墼璺匡里量苎塞兰堂量蔓±选芏苎煎煎金丝塞基 1．2方法 1．2．1病毒核酸的制备 收获M9lG27感染12～14日龄易感鹅胚尿囊液，经差速离心与超速离心后，收集的病毒液再 等量苯酚一氯仿一异戊醇25：24；1)抽提两次，等量氰仿一异戊醇(24：1)抽提一次，乙醇沉淀核酸， 70％乙醇漂洗，室温干燥后用TE悬浮，为模板DNA备用。 1．2．2引物设计 参照国外发表的全基因序列白行设计一对引物，由中科院上海植物生理研究所合成。其引物序 列 P1： 57一ATCGTTAACATGGCAGAGGGAGGAA一3’；P2： ∥一CCGCGCGAGCT— I 为1627bp，其中Pl包含有编码V