柔嫩艾美耳球虫抗药性虫体纯化及mRNA差异显示的研究.pdf

中文摘要 球虫病是集约化的养鸡场危害晟火的疫病之一，目前其防治仍不能离开抗球虫药，但药物 饺州过程中不可避免的会产生抗药性．因此，我们选择抗药性这个球虫病防iff中的重要课题进行 研究．采_I{j玻璃纸法进行了柔嫩艾美耳球虫(Ei口eriatenella)的单卵囊感染车¨单孢子囊克隆， 采川过滤、离心分离和DE．52纤维索柱层析系列方法纯化了不同虫株球虫的裂殖子，对不同虫株 的裂殖子进行了mRNA差异显示，进行了实验室球虫抗药性分子检测方法的初步应用。 单卵囊纯化和单孢子囊克隆。JI=}j单卵囊感染技术，对柔嫩艾荚耳球虫卵囊进行了分离纯化， 实验室单卵囊感染26只鸡，饱和盐水漂浮集卵法进行检测，成功率达38％；首次采用单孢子囊克 隆技术，在国内对柔嫩艾美耳球虫进行了克隆，单孢子囊感染35只鸡，10只鸡感染成功，成功 率28．6％。结果获得了遗传上单一的上海马杜霉素敏感和抗药虫株，甘肃地克珠利敏感和抗药的 虫株，该单卵囊分离纯化和单孢子囊克隆技术简单易行。 不同虫株的裂殖子的分离纯化。12日龄的肉用雏鸡，感染1．5×103个卵囊，采用标准分样 筛过滤、离心分离和DEAE-52纤维素柱层析，纯化了2个敏感虫株和2个抗药虫株裂殖子，通 17×10’个，其中 7个，平均每只鸡获得裂殖子6 化，从30只鸡盲肠黏膜中纯化裂殖子1．85×lO 杂质极少，其纯度适用于mRNA差异显示等分子生物学研究．分别分离纯化了柔嫩艾美耳球虫马 杜霉素敏感虫株和抗药虫株5×105个裂殖子。 柔嫩艾美耳球虫敏感虫株和抗药虫株的mRN^差异显示。采用锚定引物和I随机引物，首次对 点杂交鉴定4个片段为阳性，对阳性克隆测序、同源性比较。来自于马杜霉素抗药虫株裂殖予的 线一5蛋白与虫体融解宿主细胞膜、入侵、运动和溢出有关，在第二代裂殖子时期，抗药性虫株该 序列发生转录，而在敏感虫株中沉默。HCDl序列米臼马杜霉索敏感虫株，该片段与柔嫩艾美耳球 86％，没有该表面抗原功能的报道。AGD5片段米白 虫表面抗原16和17序列同源性分别为83％雨1 抗药虫株，EA．D8—2序列来自敏感虫株。通过比较认定这两条序列为新序列，它们所代表的基lj司的 意义尚不清楚。 实验室球虫抗药性分子检测的初步研究。选择在敏感虫株中沉默，抗曲虫株中表达的特异 序列AGD5设计检测引物，采J{}j 1株地 够鉴别马杜霉素抗药虫株羊¨3株马杜霉素敏感虫株(2株对所有药物敏感的不同地理株t 克珠利抗药性虫株)：此鉴定结果与鸡体试验的结果一致。说明敏感虫株羽I抗约虫株的在该序列 15杜霉索抗药性虫株。 的筹异发生在转录水平。以卵囊的总DNA为模板PcR方法却不能鉴别敏感雨l 关键词：柔嫩艾美耳球虫；抗药性；纯化：mRNA筹异显示。 Abstract isolation and ofEimeriatenellcL Singleoocyst singlesporneystcloning The infaecesof oocysts theehickenswereidentifiedunder aftersaturated sodiumchloride microscope solution floating．Oocyst was and the o