琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物PPT.ppt

实验二 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 ; 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论 ;实验目的 ;实验原理 ;DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系，可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。 ;溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。;注意事项：;实验仪器、材料与试剂 ;;（二） 材料 实验一中的PCR产物 ;（三） 试剂 1.琼脂糖 2. TAE电泳缓冲液(50×) （pH8.0） Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。 4. 10×DNA样品上样缓冲液 ;溴化乙锭（EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。;电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。 ;实验步骤：琼脂糖凝胶制备;6. 室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中。 7. 加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm。 8.在DNA样品中加入2 μL (1/10体积)的10× DNA上样缓冲液(loading buffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底。 9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。;;;;; 10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。 11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳。 12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。 13.. 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中，放于4℃保存，以备下实验用。 ;;PCR产物的 琼脂糖凝胶电泳; ;;使用3 mg的DNA Marker DL　2,000（500 ng/条带）进行1%的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。;关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法几点注意事项：;此外在琼脂糖凝胶电泳中其它注意事项还有： 1.）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观察电泳状态，但EB会导致线形DNA迁移率下降。 ２.）电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与DNA泳动的方向相反，较长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中溴化乙锭含量低，会对含量较少的小分子DNA片段检测困难。处理方法是：将凝胶在0.5ug/ml的EB溶液中染色30－45分钟。 ３.）判断正负极的另一方法是负极气泡（H2）比正极气泡（O2）多一倍。 ;问答题 1.影响电泳迁移率的因素有哪些？ 2.试述琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理。 ;用多功能DNA纯化回收试剂盒（离心柱型）回收DNA;1．在长波紫外灯下,用干净刀片将所需回收的DNA条带切下,尽量切除不含DNA的凝胶,得到凝胶体积越小越好。 2．将切下含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心管,称重。 先称一个空1.5ml离心管重量,然后放入凝胶块后再称一次,两次重量相减,得到凝胶的重量。 3. 加三倍体积溶胶/结合液DB。 如果凝胶重为0.1g,其体积可视为100μl,则加入300μl溶胶液。 4．56℃水浴放置5分钟（或直至胶完全溶解）。每2-3分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解。 ;5．将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中）, 12,000 rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。 如果总体积超过750μl，可分两次将溶液加入同一个吸附柱AC中。 6．加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!）,12,00