基金申请的策略和技巧[中山大学 黎明涛]PPT.ppt

基金申请的策略和技巧;基金申请;撰写前的准备;摘 要 研究内容和意义（限400字）;研究内容、研究目标与拟解决的关键问题;研究目标 获得SP1直接调控bim基因表达的可靠证据，阐明促凋亡蛋白Bim由SP1转录调控的新机制，为确立SP1作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的科学依据。 要求：明确、具体 解决学术问题; 研究内容 （紧紧围绕研究目标） 1.??证明bim启动子核心区的SP1结合序列是否介导了bim基因的上调 为了证实bim启动子核心区的SP1结合序列是否介导了bim基因的上调，将其中的SP1结合序列进行点突变，使其不能结合SP1；确定这一突变是否能够消除bim启动子的撤钾反应。 2.??分析SP1 是否能够与bim启动子核心区的SP1结合序列结合 应用EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)技术，证实bim启动子核心区的SP1 结合序列是否能够与SP1结合；进一步采用CHIP(Chromatin immunoprecipitation)方法，获得SP1与bim启动子核心区在细胞内结合的证据。 3.??从 bim 的mRNA 和蛋白质水平，观察负显性SP1是否能够抑制撤钾诱导的bim基因的上调 质粒转染CGNs的转染率只能达到0.1-1.0 %，腺病毒的感染率可达70－80%[1]。 因此，构建dnSP1的腺病毒载体Ad-dnSP1，感染CGNs才能达到可靠分析bim的mRNA和蛋白质表达水平改变的目的。 4. 分析SP1诱导Bim这一机制对神经元凋亡的调控作用 确立SP1转录激活bim这一机制后，进一步分析这一机制对神经元凋亡的调控作用。 ; 拟解决的关键问题 获得SP1直接调控bim基因表达的可靠依据。 什么是关键问题？ — 研究过程中对达到预期目标有重要影响的某些研究内容或因素。 — 为达到预期目标所必须掌握的关键技术或研究手段。 ; 研 究 方 案 项目需求为前提； 可靠性第一，先进性第二； 参考文献； 突出关键技术的描述； 不主张使用流程图，建议开头：“有关方法、技术路线、试 验手段、关键技术综述如下……”。 ;可行性分析 －从学术思想角度提出; 创 新 性 对创新的理解：创新性与先进性是有根本区别的。 原始创新： 填补空白或修改传统的理论； 新技术、新方法的发明创造。 跟踪创新： 在前人工作基础上补充、完善现有理论； 对原有技术、方法进行修改后产生1＋1＞2的效果。;本项目的特色与创新之处： 申请人首次报道了神经元凋亡时促凋亡蛋白Bim上调是不依赖于JNK/c-Jun通路(Leyu Shi,et al, Neurosci Lett. 2005)一观察之后，又以可靠的实验结果证明PI3K/Akt/FKHRL1信号通路也不参与bim的上调（见立项依据）。 bim上调的转录机制是什么？我们率先对bim启动子进行了5‘末端序列续减分析，确立了诱导bim表达的启动子核心区， 进而发现一个典型的转录因子SP1结合序列位于其中。进一步实验显示：神经元凋亡时SP1被激活；负显性SP1突变体和SP1-DNA结合抑制剂mithramycin A可抑制bim的上调。根据以上生物信息学分析和实验观察，我们首次提出了SP1介导bim上调这一新的bim转录机制：神经元凋亡时转录因子SP1被激活，激活的SP1与bim启动子核心区的SP1结合序列结合，从而转录激活bim的表达。 本项目拟进一步采用负显性SP1突变体的腺病毒表达技术以及启动子点突变、EMSA和CHIP方法，旨在获得SP1直接调控bim基因的可靠证据，为阐明SP1对促凋亡蛋白Bim的调控作用和机制并进一步确立SP1作为神经退行性疾病治疗的新靶点提供更充分的科学依据。 ; 研究基础与工作条件 —突出与项目相关的工作积累;研究 基 础 ; 3. Bim启动子核心区确立 启动子5‘末端序列续减分析确立了诱导Bim表达的启动子核 心区，并发现一个典型的转录因子SP1结合序列位于其中。进一步实验显示：神经元凋亡时SP1被激活；负显性SP1突变体和SP1-DNA结合抑制剂均可抑制Bim的上调。这些实验资料揭示了SP1介导 bim转录调控的新机制，也为本项目申请提供了最根本的实验依据。 4. 转录因子调控神经元凋亡的工作基础 另一项转录因子MEF2抗神经元凋亡的工作也显示了申请人与本项目相关的较扎实的研究工作积累。本人首次报道(Mingtao Li,