多个抗虫基因转化超甜玉米的研讨.pdf

摘 要 超甜玉米义称水果或蔬菜玉米，已经成为当今tlr界重要的一类栽培作物。然而，由 于玉米螟危害造成产量损失和刮质下降日趋严重。超甜玉米抗虫种质资源相对贫乏，本 身缺少有效的抗虫基囚资Dr,通过常规育种方法在短期内难以获得抗性品种。近年来， 国内外应用植物转基因技术开辟了拉物遗传改良的新途径。木研究在建立高效稳定基因 转化受体系统的基础上，利用基因枪和子房注射两种方法将多个抗虫基因成功转化抗性 较差的超甜玉米自交系及其品种.并从分子水平和目标性状上研究外源荃因的转入、整 合和表达。本研究得出的主要结果如下: 1研究了影响超甜玉米愈伤组织诱导和胚性形成的几个关键因素，建立了超甜玉 米基因转化的愈伤组织受体系统。在取材上，白交系1132和粤甜3号以胚大小在1.0-2.0 二为宜。在诱导愈伤组织上，两种基因型都是高诱导力的材料，而自交系1132能够诱 导出高质量的n型胚性愈伤是理想的基因转化材乖a。两种基因型在2.4-D浓度为2mg/L 时，出愈率和胚性愈伤率达到最高，胚性愈伤率分别达到45.88%和35.00%;在培养基 中添加9mg/L的AgNO,极显著地提高了胚性愈伤率，比对照提高了31.25%,AgN。在愈伤 组织的诱导及改善愈伤组织的质量方面有着显著的作用。而通过添加700mg/L的脯氨酸 胚性愈伤率显著地提高了12.41%,脯氨酸具有调节渗透压和促进愈伤胚性化的作用。 Basta筛选转化体适宜浓度为5mg/Lo 2通过优化再生和生根壮苗、移栽等条件提高分化再生频率，减少无性变异，建 立了稳定、高效的超甜玉米转化后再生成株系统。研究表明，随着继代时间的延长，再 生率降低直至很难再生成苗，长期继代不利于再生.蔗糖、甘露醇,ABA浓度分别为40g/L, 20g/L,5.Omg/L时胚性保持率达100%0通过蔗糖和激素配比，筛选到了一个高效、稳 定的再生培养基，即蔗糖、6-BA,NAA分别为20g/1.,2.Omg/L,O.lmg/L时，愈伤组织 分化和再生率最高，分别为81.13%和35.85%。低浓度的NAA可使再生苗的生根率达到 57.72%,随着NAA和IBA浓度的增加，生根率提高到98.66%a通过激素的调竹得到一个 既能促进生根壮苗又能减少无性变异的培养基。 3利用琴因枪成功地将多个抗虫基因转化超甜玉米白交系1132，获得31株再生植 株，其中26株可育。对TO代转化植株PCR和Southern杂交分析表明，在编号为1,5, 6,9,10的超甜玉米植株中整合了Bt基因，在1,9,13,23,24,26,27,29的单株中存在RIP 基因，1,5,6,9,10植株中还整合有GNA基因，在8,11,12,13,15-29的植株中都整合有 Pin基因，据此推断，在检测的部分转基因拉株中同时祭合有2-3个目的基因，其它植 株则整合有1个目的基因，目的基因多以单位点整合在转基因植株中。通过对转基因T1 代部分植株Southern杂交证明，部分植株呈阳性，整合有RIP或GNA基因，证明目的 基因能够在后代中稳定整合并遗传。RT-PCR分析表明，Pin和GNA基因在转基因T2代 部分植株中得到了表达。 4对转基因T1代5个株系G9,G24,G25,G26,G27室内人工接虫抗性鉴定表明， 饲喂6d后转基因植株明显抑制玉米螟幼虫的发育，幼虫体重增加缓慢。5个转基因株系 平均死亡率为74.25%，显著高于对照平均死亡率46.67%,死亡率80%的植株占42.5%, 有的单株饲喂后玉米螟死亡率高达100%，但不同单株间的抗性存在差异，大多数植株表 现较强的抗性，甚至达到高抗，但也有少部分植株抗性较弱或不抗。 5用子房注射法成功地将抗虫基因导入超甜玉米品种粤甜3号，获得了1株整合 有Bt基因的转基因植株，定名为ZT11，以发芽成苗的植株计算，基因转化效率达9.09%, 经PCR和Southernblot分析，证明抗虫基因已经整合在超甜玉米基因组中，并且为单 拷贝。T1代植株分子检测结果表明，33,35,37,44,45单株中整合了Bt基因，证明Bt 基因能够在转基因后代植株中稳定遗传，基因分离符合1:1的孟德尔遗传分离规律， 通过田间自然发生和室内接虫鉴定转基因T1代部分植株表现明显的抗虫效果。 本研究结果将为抗虫基因在转基因超甜玉米中的遗传行为、育种资源的培育及其他 基因转化超甜玉米研究奠定了基础。 关键词:超甜玉米 抗虫基因