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生物化学实验技术 生物化学实验技术 实 验一、 双缩脲法测定蛋白质含量 实 验二 、紫外分光光度法测定蛋白质含量 实 验三 、血清γ-球蛋白的分离与纯化 实 验四、碱性磷酸酶Km值测定 实 验五、胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响 实 验六、 血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析 实 验七、 SGPT活性测定 实 验八、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶 实 验九 、RNA的分离与鉴定 实 验十 、DEAE 纤维素离子交换层析法分离蛋白质 实 验十一、 质粒的提取与鉴定 【目的要求】 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理。 【实验器材】 中试管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计 【方法步骤】 取中试管3支，按下表操作。 各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。 【注意事项】 1．正确使用微量加样器。 2．取液要准确。 3. 做好标记，不要将试管号弄混。 【思考题】 1．分光光度计的使用及计算原理。 紫外分光光度法测定蛋白质含量 【目的要求】 ①了解分光光度法的基本原理； ②能较熟练使用紫外分光光度计。 【实验器材】 1．紫外分光光度计。 2．微量加样器。 3．蛋白标准液（1mg/ml）。 【方法步骤】 1．标准蛋白质溶液：任选一种蛋白质溶液，经凯氏定氮法测定蛋白质的含量后，用生理盐水稀释成浓度为1mg/ml的蛋白质溶液。 2．标准曲线的制作：取试管6只，按下表操作 混匀，以第六管调零点，280nm波长处比色。用光径为1cm的石英杯测定各管吸光度，以各管的吸光度值为纵坐标，计算各管内蛋白质的浓度，以蛋白质的浓度为横坐标绘制标准曲线。 3．标本测定：用生理盐水将待测蛋白质样品稀释成大约1mg/ml溶液。取1.0ml样加生理盐水3.0ml混匀，按上述方法测其吸光度。 【结果与分析】 1．根据标准曲线查出蛋白质浓度。 2．也可利用经验公式计算蛋白质含量；适当稀释蛋白质溶液测其A280nm和A260nm处吸光度，再用经验公式直接计算蛋白质浓度。 如Lowry-Kalckar公式：蛋白质浓度（mg/ml）＝1.45A280－0.74A260。 【注意事项】 1．加量要准确。 2．比色皿的正确应用。 3．结果重复3次，取平均值。 【思考题】 1．为何要同时测定蛋白280nm和260nm处的光吸收值？ 1．?掌握蛋白质分离纯化的主要方法和原理；2．熟悉盐析和层析的基本操作；3． 掌握离心机的正确使用方法。 【仪器试剂】 试管、刻度吸管、吸耳球、胶头滴管、层析柱、反应板；血清、PBS液、葡聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、饱和硫酸铵溶液。 【实验原理 】 1．盐析 ⑴ 血清2ml放入离心管中，加入PBS2ml混匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液4ml，边加边摇匀。静置10分钟后，离心3000 rpm 10分钟，倾上清液（上清中主要含清蛋白）。 ⑴ 装柱：将制好的葡聚糖凝胶混匀，倾入层析柱内，静止后分层，凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间。当液面接近凝胶上表面时将出口胶管夹紧待用。 1．?使用离心机前注意配平； 2．?装柱要均匀，不要有气泡和分层，凝胶面要平整； 3．凝胶高度要在柱高的1/3~3/4之间； 4．脱盐时不能冲击凝胶面，PBS液面不能降到凝胶面以下； 5．实验后将凝胶中盐洗脱干净后回收再利用。 【思考题】 1.装柱不均匀，凝胶面不平整对实验结果有什么影响？ 2. 盐析与变性的异同？ 3．凝胶层析的原理？ 1. 掌握电泳的基本原理；2. 熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法和  应用。  【仪器试剂】 电泳仪、点样器、镊子、醋酸纤维素薄膜；巴比妥缓冲液、染色液、漂洗掖。 【实验原理 】 1. 准备与点样：用巴比妥缓冲液将醋酸纤维素薄膜充分浸透，在毛面距一端1.5厘米处点样，即上述实验得到的γ-蛋白，另取薄膜一点全血清。 2. 电泳：点样面朝下，点样端靠近负极，电压110V，通电40-45min； 3．染色：2-5 min； 4. 脱色：直至背景漂净为止。 1．不要用手触摸纤维素膜； 2．注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛 面； 3．点样位置要在1.5厘米以内，不要距边缘 太近，不要重复点样； 4．膜放进电泳槽时，将点样面向下，点样端靠近阴极； 【思考题】 如果电泳结果证实γ球蛋白的分离效果不理想，应从哪些方面分析？ 实 验 四 碱性磷酸酶Km值测定 【目的要求】 ①了解酶促反应的影响因素； ②掌握Km的意义和测定方法； ③了解底物浓度与酶活性的关系。 【实验器材】 1．可见分光光度计。 2．微量加样器。 3．0.025U/ml的酶液。 【方法