山羊PTHrP基因干扰重组腺病毒的制备与鉴定.PDF

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2011, November 25; 27(11): 1555−1563 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ ©2011 CJB, All rights reserved. 动物及兽医生物技术 PTHrP 邢瑞芳，郑惠玲，刘雪梅，闫林慧，安俊辉，杨振宇，祝珍珍 西北农林科技大学 动物科技学院，杨凌 712100 摘 要: 甲状旁腺激素相关蛋白 (Parathyroid hormone related protein ，PTHrP) 具有广泛生物学功能，对调控钙代谢具 有重要作用。采用 RNA 干扰和重组腺病毒技术，对山羊乳腺上皮细胞中PTHrP 基因表达进行沉默，为进一步研究该 基因在乳腺上皮细胞中的功能奠定基础。采用BLOCK-iT shRNA 腺病毒干扰系统，将设计好的寡聚shRNA-322/357 经 退火复性后插入穿梭质粒pENTR/CMV-GFP/U6 中。经Western blotting 检测干扰效率后，选择pENTR/CMV-GFP/U6-322 与病毒骨架质粒 pAd/PL-DEST 进行同源重组，成功获得重组干扰腺病毒载体 pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-322 ，并转 9 染HEK-293 细胞，通过包装、扩增后产生干扰重组腺病毒AD-PTHrP-322 ，TCID50 法测定其滴度为2.0×10 PFU/mL 。 用AD-PTHrP-322 感染山羊原代乳腺上皮细胞(MOI=200) ，经实时定量PCR 及Western blotting 检测表明在病毒感染 24 h 、48 h 和72 h 后，山羊乳腺上皮细胞中PTHrP mRNA 表达量分别下调了29.2 ％、68.1 ％和82.6 ％ (P ＜0.05) ，其 蛋白表达水平也明显下调，干扰效果明显。 关键词: 山羊，甲状旁腺激素相关蛋白，RNA 干扰，腺病毒 Preparation and identification of recombinant adenoviruses carrying short hairpin RNA targeting parathyroid hormone related protein of goat Ruifang Xing, Huiling Zheng, Xuemei Liu, Linhui Yan, Junhui An, Zhenyu Yang, and Zhenzhen Zhu College of Animal Science and Technology, Northwest A F University, Yangling 712100, China Abstract: Parathyroid hormone related protein (PTHrP) has important biological functions in calcium metabolism. The aim of this study was to silence the expression of PTHrP by RNA interference and recombinant adenovirus, and to provide a material to investigate the relative functions of PTHrP in goat mammary gland epithelial cell. The Block-iT shRNA interferenc