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P53基因在血细胞中的表达 RT-PCR的应用 技术介绍：RT-PCR RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR RT- PCR首先经反转录酶的作用以RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。 RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。 实验原理 在血细胞里面提取RNA，以其mRNA为模板，然后逆转录为cDNA，再通过pcr技术进行扩增，进行20-30次，达一定量后进行电泳分析，根据其浓度即可判断该基因在血细胞中是否表达以及表达的程度。 p53基因序列的获取 在Genbank上有哪些信誉好的足球投注网站AF136270.1得到p53基因的序列，显示有8个外显子，为了提高特异性，选择包含2个外显子的序列，选择外显子3和7，复制其对应的序列拼接在一起，在genbank的设计引物工具里面获取引物序列。详细步骤如下： 获取基因序列 NCBI (National Center for Biotechnology Information）是指美国国立生物技术信息中心。 NCBI的任务是发展新的信息学技术来帮助对那些控制健康和疾病的基本分子和遗传过程的理解。 序列有8个外显子 选择的是3和7两个外显子，上面数字指这个外显子，该选择只是为了使其特异性更高，便于提高实验准确度。 该基因全部碱基序列 这是p53基因的全部碱基序列， 找到3号和7号所对应的序列， 复制其序列，然后打开genbank 所提供的引物设计工具 引物设计步骤 将3号和7号外显子序列复制到右图 框中，条件已经设定好，其Tm值为 57-63℃之间 得到的引物序列 上一步中得到的引物序列提供了10个待选择，可以看出给了碱基序列、长度Tm值、GC%等数据供参考 设计工具所给的前4个引物序列对比 引物设计原则 1、长度：15—30bp，其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。 2、G十c含量：应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。 3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。 4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。 5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。 6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。 7、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。 最佳引物 根据上述引物设计原则，选择第一个引物序列， 其Tm值符合条件，GC%在合理范围内 血细胞RNA提取 1、冰冷的PBS液 5-10ml洗涤细胞两次，加入Trizol 1ml，混匀，室温静置15min ２、小滴管吹打，使细胞完全裂解，然后完全转移至1.5ml EP管内 3、加入0.2ml的氯仿，剧烈震荡混匀30s。室温静置10min，上层水相，下层为酚相 4、4度离心，15000rpm，15min 5、将上层水相移至另一EP管内，400-500ul，切勿吸到蛋白，加入等量的异丙醇，充分混匀，室温静置10min。然后4度，15000rpm，离心10min 6、弃掉上清，加入冰冷的75%乙醇漂洗两次，用移液器将液体吸干，室温干燥10-20分钟，待产物呈半透明状，加入20ul DEPC处理过的水溶解RNA PBS Trizol 成分 磷酸缓冲盐溶液 RNA抽提试剂 RT-PCR反应 反应条件及试剂 RT第一步 RNA????抽提物 5μl 引物 2μl RNA sin 0.5μl 65℃?15分钟 立即放入冰浴 RT第二步 RNA sin 0.5μl 10mM??dNTP 1μl 5×RT??缓冲液 4μl 25mM??MgCl2 4μl AMV??逆转录酶 3μl 37℃?1.5小时 94℃?5-10分钟 进行PCR 反应条件及试剂 PCR第一步 PCR第二步 25mM??MgCl2 3μl 10×PCR?缓冲液 5μl 10mM??dNTP 1μl 上下游引物10pmol/μl 2.5μl×2 CDNA模板 5μl ddH2O 30μl Taq酶 1μl 轻质石蜡油 50μl ? 100μl 25mM??MgCl2 2μl 10×PCR?缓冲液 5μl 10mM??dNTP 1μl 上下游引物10pmol/μl 2