三、大规模细胞培养技术.doc

三、大规模细胞培养技术 ? 这里所说的细胞培养包括微生物和动植物细胞的培养；所谓大规模培养是指有别于实验室的培养而言。在实验室中进行细胞培养主要是掌握细胞的生长、繁殖、生理、生化等规律，所采用方法和仪器要求精密，但处理量很小，如在好气菌的液体培养时，一般采用扁瓶或摇瓶，靠瓶口的棉塞进行供氧。在生产中，培养细胞的目的是为了收集大量的细胞（如面包酵母、非分泌型重组大肠杆菌）或通过细胞的催化作用大量生产代谢产物（如氨基酸和抗生素）或进行生物转化（如甾体化合物的转化、污水处理）。由于细胞培养量大，所采用的容器也必然很大，但单位液体体积所占有的液体表面却比小型容器少得多，不可能再采用表面通气或震荡的方法来供氧了。带有通气和搅拌装置的生物反应器正是为了适应大规模细胞培养才产生的。此外，在工业生产中，还需考虑经济有效、方便可行和可进行人为控制等因素。为此，环绕大规模细胞培养有不少带有共性的工程技术问题，如氧的供需、物质传递、细胞生长和产物形成动力学、生物反应器的结构和操作、过程检测与控制等。这些问题有的将在以后诸节中介绍，本节将着重介绍各类细胞培养的特点、氧的供需和各种培养方式三个问题。 1.各类细胞的培养特点 在微生物范围内，细菌、放线菌、酵母、霉菌中的不少菌株常用来进行发酵、微生物转化或作为基因工程的宿主。在动物细胞中，哺乳动物的某些淋巴细胞、表皮（包括皮肤以及器官、体腔的表层组织）细胞、成纤维细胞的细胞系以及某些鱼、昆虫细胞系可以用来进行传代培养。其中淋巴细胞常用来与骨髓癌细胞经原生质体融合形成各种杂交瘤以生产单克隆抗体，或通过病毒的刺激生产干扰素；表皮及成纤维细胞中某些细胞系可用来进一步培养病毒以生产疫苗，有的可作为基因工程的宿主。由于动物细胞属结构和功能齐全的真核细胞，因此对外源基因的表达更为完整和正确，且可以获得结合蛋白产品。在植物界中，几乎所有的双子叶、单子叶、裸子植物以及蕨、藓都能进行细胞培养。某些植物细胞系可以用来生产次级代谢产物。 有关常用微生物、哺乳动物及植物细胞在培养过程中的特点及差异列于表5—1中。 2.氧的需求和供应 除了厌气微生物外，其他微生物以及动植物细胞培养过程中都需要一定数量的溶解于培养液中的氧，作为细胞对碳源进行生物氧化之用。各种细胞在培养过程中所需的氧量与细胞类别，甚至品种有关，还与所利用的基质有关，当用烃类作基质时，其需氧量就比醇类较高，比糖类更高。此外，在利用细胞的某些代谢作用进行某目标产物的生物合成或生物转化时，也需要消耗一定的氧。由于在利用细胞生产某一产物时，很难分清用于生长繁殖和产物形成各需多少氧，而只能笼统地给出一个对某一产物生产时的需氧量。 ? 需氧量常有两种表示法：一是以摄氧率（OUR）r表示，其单位是毫摩/（升·时）；二是以呼吸强度QO2表示，其单位常是毫摩/（克（干细胞）·时）。各类细胞的摄氧率或呼吸强度值可参见表5—1。 氧在水中的溶解度甚小，如 25℃、1大气压（0.1兆帕）下，其饱和浓度仅为 0.24毫摩/升，约合 7.7毫克/升，也即7.7ppm（约为葡萄糖在同条件下的溶解度的1/6000）。氧的溶解度随温度升高而降低，随压力的增大而增加，若水中含有无机和有机物时均使溶解度下降。在实际生物反应器（常保持0.12～0.15兆帕，即1.2～1.5大气压）中，培养液的饱和氧浓度不会高于8ppm（指在未接种时培养基被空气饱和的场合）。因此，在细胞培养或发酵过程中应连续不断地向反应器中通入具有一定压力的无菌空气，以供细胞生长繁殖和产物形成的需要，否则将会严重影响培养或发酵，以至无法进行正常生产。一般情况下，应保持培养（发酵）液中的氧饱和度在10％～30％的范围中。 我们已经知道，培养（发酵）过程中需要的氧来自导入空气形成的气泡。氧从气泡进入液相主流，存在着一个物质传递问题。氧传递速率（OTR），与搅拌、通气强度有关，也与培养液中溶解氧浓度、粘度等因素有关。当培养（发酵）过程中供氧等于需氧，即OTR=OUR时，培养（发酵）液中的溶氧浓度CLL会不断上升，直至达到一个新的稳定值；同样，在OTR＜OUR时，CL会下降至一个稳定值。 应该指出的是细胞的摄氧率r值在培养（发酵）过程中不是一成不变的。在培养初期，细胞的生命力很强，呼吸强度虽较大，但细胞浓度很低，因此r值并不大；在培养（发酵）末期，因部分细胞衰老或死亡，基质消耗将尽，r值也不会很大，且不断下降；r最大值出现在培养中期，特别是在细胞处于对数生长的中后期。 氧的传递速率在培养（发酵）过程中也是会变化的，这主要是由于培养（发酵）液的物理性质在过程中发生了较大变化而引起的。 3.大规模细胞培养方法 (1)分批培养由于细胞遗传性能的不稳定性以及存在着长时期维持纯种培养的困难性，在生产中的细胞培养一般采用分批培养法，即将基质和各种营养物质配成