免疫组化化学理论及技术.ppt

* * 免疫组织化学理论及技术 一、 免疫组织化学的基本概念： 组织化学： 免疫组织化学：是组织化学的一个分支即组成部分，它以免疫学的抗原抗体反应基本原理为其特点，同时还具备组织化学的一般特征。是指应用免疫学原理，通过特异的抗原抗体反应，附一可见的标志物，在组织原位显示抗原成分的方法 。 肿瘤及各种疾病的病理学研究概括起来主要 在基因和蛋白水平上进行的研究。 免疫组织化学方法主要用于基因蛋白质水平表达的研究。 蛋白表达的分布，定位，定量； 蛋白表达与疾病的关系； 蛋白表达与肿瘤生物学行为及预后关系等。 二、基本物质： （一）抗体：主要有两大类： 1、多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。 2、单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。 （二）显示物： 主要有： 1、酶标反应： ①碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,AP） ②辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase, HRP) AP与不同的底物作用，可形成不同颜色的终产物。 与萘酚（As-Mx）和快蓝（Fast blue）作用； 与快红（Fast red）作用。 缺点：形成的沉淀溶于有机溶剂。 但利用新品红（New fuchsine）显色，可形成 不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。 HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕色沉淀， 不溶于有机溶剂，不褪色。 2、免疫荧光：通过荧光素标记抗体，借助荧光显微 镜观察荧光的发光物质。 ①异硫氰酸荧光素（Fluorescien isothioyarale, FITC） 520－530nm ②四甲基异硫氰酸罗达明（Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC） 620nm ③四乙基罗达明（Teraethyle rhodamine B200, RB200） 590－600nm 3、胶体金： 指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中， 对同一种物质的水溶液，粒子大小不同呈现的 颜色亦不同），5－60nm范围呈红色。 三、主要方法： （一）、直接法： （二）、间接法：特点：是经过了第二抗体放大 效应 （三）、PAP法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体 形成复合物，通过第二抗体的桥接与第 一抗体结合，然后以酶底物反应检出。 （四）、ABC法： 生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）为具有高度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4个生物素。当生物素标上特定的标记物质后or与抗体结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物素的结合反应，而以适当方式显示。 （五）、S-P法（LSAB）： 采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测定细胞和组织中的抗原。 （六）、EnvisionⅠ法（二步法）： 原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRP or AP）复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多的HRP分子，使信号有显著提高，敏感性较PAP法，ABC法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方法更省时，简便。 四、以LSAB法为例简单介绍染色步骤： ①石蜡切片脱蜡－水； ②3%H202抑制内源性过氧化物酶15min； ③每张切片加10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育5min； ④加特异性一抗，370C孵育30－60min，or 40C过夜； ⑤加20ul生物素标记的第二抗体，370C，30min； ⑥加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素，370C， 30min； ⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min； ⑧用过氧化物酶基质液（DAB基质液）显色5－ 15min。在光镜下观察。 ⑨自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝， 梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树 胶封固。 五、免疫组化常见问题的处理： 1、组织材料的处理： 常用的固定液为：10%中性福尔马林液； 4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4）； 固定时间：8-24hr 组织大小：2*1.5*0.3cm 2、防脱片处理： 多聚-L-赖氨酸； 硫酸铬钾明胶液。 3、增强特异性染色的措施和方法：