反义核酸技术及应用.ppt

反义核酸技术及应用 四川省临床检验中心 邓君 主要内容 反义核酸技术的作用机制 反义核酸技术的实验研究 反义核酸技术的应用前景 * * 一、反义核酸技术的作用机制 1.什么是反义核酸（AS-ODN）技术？ 利用碱基互补原理，用人工合成或生物合成的特定互补的DNA或RNA序列，导入靶细胞，形成mRNA-DNA或mRNA-RNA杂交双链，从而抑制或封闭基因表达，使其丧失活性，达到基因控制和治疗的目的。 2.反义核酸技术的研究进展 1978年：Stephenson和Zammeenik首次报道反义核酸技术； 1984年：Izant和Weintraub报道反义核酸技术在基因治疗中的应用； 2000年：随着先进的基因克隆、基因测序和DNA合成技术的发展，反义核酸技术有望在分子水平治疗各种疾病。 3.反义核酸的设计 统计表明，人类基因组中只能出现一次的核苷酸序列数目平均为13个，故理论上设计一个有15个以上碱基（15～25个）特异序列的反义核酸，能针对人类基因组中任何的单个基因作为靶点，从而调控基因表达。 4.AS-ODN的作用机制： 设计AS-ODN定向互补到靶DNA，严格按碱基互补配对原则，抑制mRNA的表达，并阻断mRNA进入胞浆，阻断翻译过程。 AS-ODN进入细胞核，与核内基因组DNA连接，形成三聚体，或ODN与mRNA形成的双链与DNA双链竞争结合转录因子，阻断转录。 AS-ODN与靶蛋白连接，抑制蛋白质的加工、修饰和功能的表达。 5.反义核酸的种类 根据作用不同的分类： 与特定的表达载体（病毒、质粒）连接，导入靶细胞直接转录反义RNA，与相应mRNA形成双链，阻断翻译。 以胞吞的方式进入细胞，与相应mRNA结合发挥作用。 利用核酶的催化特性，将其与特异的靶RNA结合，裂解靶RNA，达到治疗目的。 根据来源不同的分类： 用重组DNA技术构建表达载体在细胞内转录出反义核酸； 人工合成的反义核酸； 利用诱导物诱生细胞内的反义核酸。 二、反义核酸技术的实验研究 1.反义核酸的作用或给药途径(转染) 合成的AS-ODN可直接作用于培养细胞，细胞通过吞噬等机制吸收AS-ODN； AS-ODN结合L-多聚赖氨酸、高脂嵌入剂或脂质体进入细胞，可增加其对细胞的穿透性和对核酶的耐受； 在动物模型中，可通过静脉、腹腔、皮下、肌肉、瘤体内注射或口服等途径给药。 几种转染方法优缺点的比较： 脂质体：可提高分裂细胞和非分裂细胞对核酸的摄取，并保护不被降解。优点为操作简单，细胞吸收好，缺点是包埋的DNA量不确定，在特定组织如肝脏吸收有倾向性，对脑有毒性。后来开发出PH-敏－脂质体，来降低毒性和因受体的特异分布具有的转染组织或细胞的特异性。 病毒：以其为载体，同时利用转染特性，腺病毒以其安全和高效而广泛用于反义RNA和基因治疗，可几乎转染所有哺乳动物，但不能用于家禽的转染。优点是它在快速分裂的细胞中转染效率相当高，常被作为载体用于肿瘤的治疗中，缺点是只在快速分裂的细胞中作用，使其应用受到限制。 基因枪：1990年，Wolff和Malone用表达β-gal及荧光酶基因的质粒分别对小鼠肌肉进行直接体内注射，在注射区域的肌细胞检测到该基因的表达，但直接注射法仅对骨骼肌细胞有效。 2.反义核酸的修饰与稳定性 AS-ODN必须满足的条件： 能被细胞有效摄取； 能抗血浆、体液及细胞内核酸的降解。 第一代反义核酸：对AS-ODN的磷酸基团进行修饰，如进行甲基化、硫化和乙基化等，其中硫化最为稳定和广泛应用，但在体内出现剂量依赖的毒副作用。 第二代反义核酸：混合骨架寡核苷酸（MBO）是将反义核酸的碱基、核糖和核苷酸骨架进行不同的修饰，降低了负电荷和免疫原性，增强了稳定性。 第三代反义核酸：多肽核酸（PNA）是以2－氨基乙基甘氨酸为基本单元设计的，不带电荷，有良好的蛋白酶和核酸酶的抗性，具有更好的亲和力和序列特异性。 三、检验和结果的分析 1.设置空载体转染的对照实验。 2.在体外实验检测基因产物的活性、细胞增殖、分化等生物学参数； 3.在体内实验检测动物的生物学表型的改变； 4.在分子生物学水平上： 检测靶基因的表达：Northern印迹等； 检测相应蛋白水平的变化：Western印迹、ELISA、流式细胞分析法等，一般避免使用免疫组化和免疫荧光技术。 四、反义核酸技术的应用前景 1.在肿瘤治疗中的应用 对白血病的治疗：Yukihiro利用MLL-LTG19嵌合本AS-ODN处理携带t染色体易位的早期白血病细胞系KO-CL33细胞，抑制细胞生长。 何冬梅等发现用人类端粒酶逆转录酶基因的反义核酸，可促进顺铂诱导AML和CML细胞凋亡。