嗜盐菌的分离与生理活性测定.doc

嗜盐菌的分离与生理活性测定 张兆轩 生命科学学院 生物科学 07级 2007300111 组员：陈晓文 廖永杰 指导教师:韩庆国老师 【摘要】本实验为基础性创新性实验，以加强学生自主创新为目的，锻炼学生实验操作能力，分离筛选含有蛋白酶活性的细菌。嗜盐菌作为一类新型的、极具应用前景的微生物资源，近年来受到人们的广泛关注。但是，目前对嗜盐微生物的分离还远远不够。因此，分离更多的未知嗜盐菌，包括极端嗜盐古菌和中度嗜盐菌是微生物资源开发的必要前提和关键之一。在我国存在很多高盐环境，如新疆、内蒙、青海、山东和甘肃都有大面积的盐碱化土壤和许多盐湖。这些为我们开展嗜盐微生物的分离和系统分类提供了得天独厚的条件。 我们从地区的高盐环境采集到样品，进行嗜盐研究。 嗜盐菌 【前言】嗜盐菌,又称作副溶血性弧菌。海水是它的乐园,盐腌的食品又是它栖居之地。海鱼、海蟹、海贝等海产品，以及不太咸的咸菜、咸蛋、腌鱼、腌肉之类一旦沾上嗜盐菌就会大量繁殖，速度十分惊人。实验表明，该菌最喜欢含盐量2%—4%的环境，在5%—6%的高盐浓度或营养丰富的低盐浓度都会孽生。尤其是温度适宜的夏季，10个嗜盐菌在3—4小时后就会育出数百万个后代。这是一个可怕的天文数字，但人的肉眼和其他感觉器官难以察觉。嗜盐菌是科学家们在死海中发现的极细小微生物。科学家们研究嗜盐菌，发现嗜盐菌似乎是修复DNA损伤的高手，研究人员用辐射轰击法破坏嗜盐菌的DNA细胞，使其分裂成碎片，但几个小时后，嗜盐菌又将染色体重新“召集”在一起。再次恢复正常功能。科学家们看中嗜盐菌的DNA修复能力，对嗜盐菌进行深入研究，使科学家们探知了更多有关生物技术和癌症的秘密，科学家们还认为嗜盐菌有助于研究和解决：如何让宇航员在太空旅行中，免受宇宙射线伤害的问题。 1.1实验材料 深圳东角头海泥 1.2实验用品 1.2.1富集培养基的配制（g/ L ) 蛋白胨 7.5；NaCl 150；酵母浸膏 10；MgSO4·7H2O 10；柠檬酸钠 3；KCl 2；FeSO4·7H2O 0.05；pH 7.0 。固体培养基：加入2%琼脂 1.2.2基本培养基（g/L） 葡萄糖 20；胰蛋白胨 1；酵母提取粉 1；硫酸镁 0.5； NaCl 5；磷酸氢二钾 6； 磷酸二氢钾 3；硫酸铵 1； 1.2.3营养肉汤培养基（g/L） 营养肉汤 36g，固体培养基加入2%琼脂 1.3实验仪器 恒温培养箱、无菌操作台、恒温摇床、冰箱、分光光度计、高压灭菌锅、移液枪，离心机、水浴锅 2实验步骤 2.1培养基配制 ①一组2－3人，每组200ml，共配1000ml。 ②灭菌完毕后，将培养基拿出，冷却。取海泥3g，加入富集培养基中，摇匀。37℃下振荡培养3天。 2.2划线分离 ①富集培养基加琼脂2%，配制橙固体培养基，灭菌后倒平板。 ②取富集培养的菌液划线分离。 ③按单菌落到估计培养基，长满平板。 2.3抗细菌活性的筛选 ①金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活化培养，培养基用肉汤培养基。注意：连续活化两次，第二次要在做抑菌实验前18小时培养。活化16－18小时的菌取1ml到50℃固体肉汤培养基中摇匀后，倒平板。打洞取嗜盐菌琼脂块于平板上，24小时看结果。 ②取上一步骤的具有透明圈的菌种2 ~ 3环至基本培养基中，振荡培养3天。将已活化的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别取2ml到50℃固体肉汤培养基中摇匀后，倒平板后迅速用胶塞打洞，并在培养基凝固前取出胶塞。把培养3天的菌液取部分到离心管，1w/r 30min离心，离心后取上清液200μl，注入上述培养基的洞中，37℃恒温培养箱，24小时后观察有无透明圈。 2.4具有蛋白酶活性的筛选 ①牛奶平板：配浓度为3％的脱脂奶粉溶液，单独灭菌（110度 ，30min)，铺平板前再与加热熔化的肉汤蛋白胨培养基混合。乘热在2倍肉汤蛋白胨固体培养基中添加同体积的牛奶溶液。 ②涂点接种。 ③1-2天后观测透明圈并拍照。 2.5耐盐度的测定 配制富集液体培养基，NaCl浓度分别为1%、5%、10%、15%、20%和25%。接种2-3环菌液至盐浓度为1%的富集培养基中，振荡培养1天。取培养了1天的1%的菌液1mL，分别加至5%-25%盐浓度的液体培养基中，振荡培养1天后，用分光光度计测定吸光值（600nm）。 2.6最适温度的测定 上述NaCl浓度为5%的菌液预先活化，各取活化后菌液1ml至6瓶富集液体培养基中，分别在35℃、45℃、50℃、55℃和60℃ 振荡培养1天后（另设一组对照组不加盐、不加菌液），用分光光度计测定吸光值（600nm） 3实验结果 出现单一菌落2个； 所有菌均无透明圈； 最适盐浓度为10%，OD值见表1； 表1 不同盐浓度下的OD值 盐浓度 1% 5% 10% 15% 20% 25% OD值 0 1.48