荧光免疫测定技术.ppt

食品安全现代生物检测技术 第一节 免疫学检测技术 第二节 PCR检测技术 第三节 转基因食品的检测技术 第一节 免疫学检测技术 一、概述 抗原与抗体的结合反应是一切免疫测定技术的最基本原理。在此基础上结合一些生化或理化方法作为信号显示或放大系统即可建立免疫测定法，如放射免疫测定法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法等。一个成功的免疫测定法必须具备3个要素：性能优良的抗体、灵敏和专一性的标记物和高效的分离手段。按照是否使用标记物分为标记免疫测定法和非标记免疫测定法，后者又称为经典免疫测定法；按反应介质分为均相或非均相(免疫复合物需分离后检测)免疫测定法；按反应状态分为平衡态或非平衡态免疫测定法。按照标记物种类，标记免疫测定法又分为放射性标记测定法和非放射性标记测定法。 目前最常用的免疫学检测技术如下： （1）放射免疫测定技术 （2）酶免疫测定技术 （3）荧光免疫测定技术 （4）发光免疫测定技术 （5）胶体金免疫测定技术 二、酶联免疫吸附试验(ELISA) （一）ELISA的基本原理 ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent assay)的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。这一方法的基本原理如下。 （1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，井保持其免疫活性； （2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性．又保留酶的活性。 （二）ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型。 1 双抗体夹心法测抗原 2 双抗原夹心法测抗体 3 间接法测抗体 4 竞争法测抗体 5 竞争法测抗原 （三）ELISA的材料与试剂 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；酶标记的抗原或抗体（结合物）；酶的底物；阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；结合物及标本的稀释液；洗涤液；酶反应终止液。 1 免疫吸附剂 2 结合物 3 酶的底物 4 洗涤液 5 酶反应终止液 6 阳性对照品和阴性对照品 7 参考标准品 三、磺胺二甲嘧啶的间接竞争ELISA检测 （一）人工完全抗原的合成 （二）合成抗原的鉴定 （三）抗体的制备与纯化 （四）标准竞争抑制曲线的制作 （五）畜产品中SM2残留的ELISA检测 （六）方法评价 1 特异性 2 灵敏度 3 准确度 4 精确度 第二节PCR检测技术 一、概述 PCR又称聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)，是1985年由美国的Kary Mullis首创并由美国Cetus公司开发的一项体外扩增DNA的方法。应用该方法可使极微量的特定DNA片段在几小时内迅速扩增至百万倍，因而一经问世便在短短的数年内就得到了迅速发晨和实际应用，并在原有基础上结合各种生化分子生物学技术衍生出了许多改良技术。这些技术显示出了巨大的潜力，发挥着越来越大的作用，也正因为如此它们被誉为20世纪80年代分子生物学革命和生物技术的飞跃。 （一）PCR原理 PCR是依据DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在体外合适的条件下以单链DNA为模板，以人工设计和合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的DNA聚合酶延5’-3’方向掺人单核苷酸来特异性的扩增DNA片段的技术。 （二）PCR反应体系 PCR反应体系主要由引物、dNTP、DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)、缓冲液、Mg2+和核酸模板组成。 （三）PCR反应参数 在PCR反应中每轮循环的各步反应时间不应过长，以免降低TaqDNA聚合酶的活性。下面介绍PCR反应中的一些具体参数。 1.变性 2.退火 3.延伸 4.循环次数 （四）常见的PCR种类 1.热启动PCR 2.一步单管PCR 3.多重PCR 4.依赖PCR的DNA指纹图谱技术 5.PCR-单链构想多态性分析 6.mRNA差异显示技术 7.随机引物扩增DNA多态性（RAPD） 8.以微卫星DNA介导的PCR技术 9.基因间重复性回文片段（REP）和基因内重复性一致序列（ERIC）的扩增 10.扩增片段长度多态性分析（AFLP） 11.限制性长度多态性分析（RFLP） 12.用于RNA病毒检测的核酸扩增技术 （五）PCR技术用于检测的主要步骤 （1）运用化学手段对目标DNA进行提取。 （2）设计并合成引物，引物设计或合成的好坏直接决定PCR扩增的成效。 （3）进行PCR扩增。 （4）克隆并筛选鉴定PCR产物，将扩增产