1蛋白质工程概论- PPT.ppt

蛋白质工程概论;前言;蛋白质工程（protein engineering）研究在过去的25年间发展迅速，已取得一批较好成果，并开始应用于医学、农业、轻工等各个领域。 2000年6月26日，人类基因组的工作草图宣告完成，并进入了后基因组时代（post-genome era）。 后基因组时代，中心任务是揭示基因组及其所包含的全部基因的功能，并在此基础上阐明生命体的遗传、进化、发育、生长、衰老、死亡的基本生物学规律，以及与人类健康和疾病相关的生物学问题。;一、蛋白质工程的概念 Protein Engineering;;妨碍酶开发利用的原因主要有： 生物材料中酶含量甚少，用传统方法分离纯化酶蛋白成本太高； 酶蛋白分子结构的稳定性差，过酸、过碱、高温、氧化等因素可破坏其结构，使其丧失生物活性，因而在工业加工条件下，酶的半衰期短，利用率低； 酶催化活性的最适pH值及底物专一性的范围较窄，与工业应用的要求有较大差距。 因此，要想扩大酶蛋白的开发利用，需要建立适当的方法，以改善酶蛋白的生物特性，使之适合于工业应用的需求，这就需要利用蛋白质工程对蛋白质进行改造。 ;2.在多肽药物、抗体以及其他活性蛋白质的基础与应用研究中，同样存在着蛋白质结构的改造问题 如白细胞介素-2（IL-2）是一种免疫反应调节因子，在医学上具有广泛的用途。结构研究证明，IL-2是由133个氨基酸残基组成的多肽，有3个半胱氨酸，1个二硫键，而125位上的半胱氨酸处于游离状态，在分离纯化IL-2的过程中，易发生二硫键错配，致使整个多肽活性降低。 定点诱变将编码链上编码125位半胱氨酸的密码子TGT转换成丝氨酸或丙氨酸的密码(TCT或GCA)，结果可以避免二硫键的错配，使产品IL-2的活性提高了7倍。;再如:单克隆抗体是很有希望的疾病治疗用药,但是,单克隆抗体技术建立起已有数十年,并早已认识到其药用价值,但至今应用不佳,原因是鼠源单抗对人来说是异体蛋白。其人源化改造需蛋白质工程才能完成。 ;（二）蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为蛋白质改造提供了理论依据;;;因此在对蛋白质进行改造之前必需对其结构与功能的关系进行充分地研究，了解影响蛋白质特性的氨基酸或氨基酸序列是哪些？改变这个（些）氨基酸是否会影响蛋白质的功能？ 蛋白质结构与功能关系研究技术主要包括蛋白质晶体学、蛋白质动力学、生物信息学等。;1．蛋白质晶体学 蛋白质晶体学（protein crystallography）是利用X射线衍射法（X-ray diffraction method）的原理解释蛋白质晶体中的原子在空间的位置与排列，并了解其与功能的关系。 20世纪50年代末用X射线晶体学方法测定了第一个蛋白质——肌红蛋白的结构. 现已有400多种蛋白质的三维结构被搞清。 ;;2．蛋白质动力学 线性多肽是如何折叠成具有三维特征的天然结构？蛋白质在与其他物质（蛋白质、核酸或酶的底物等）相互作用时，其三维结构又是经历怎样的动态过程而发挥其活性？只有了解这些问题，才能预测基因水平的改造最终会对蛋白质结构与功能产生何种后果，才能谈得上具有真正意义的分子设计，才能真正的理解生命现象。蛋白质动力学正是研究这一课题的。 ;3.生物信息学 生物信息学的神速发展为蛋白质动力学的研究提供了方便有效的技术。 生物信息学是利用计算机控制的图像显示系统，把所要研究蛋白质的已知三维结构显示在屏幕上，分析哪些残基对分子内相互作用可能是重要的，哪些残基对分子间相互作用可能是重要的。前者通常为结构的稳定所必需，后者多系分子识别及活性重要部位。 然后通过计算机按预先设想替换一些侧链基团，再用计算机寻找经过“微扰”后蛋白质分子的能量趋于极小的状态，预测由于这种替换可能造成的后果。;（三）基因工程理论和技术的发展，为蛋白质的改造和生产提供了必要的技术手段;2.定点诱变技术的建立为改造蛋白质的特性提供了技术策略 稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的相互作用，如肽键、氢键、静电作用、疏水残基间的疏水键以及二硫键等。 研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，人工改变或修饰这些氨基酸残基，有可能增加蛋白质的稳定性，又不影响其生物学活性。 ;如野生型枯草杆菌蛋白酶的218位天冬酰胺(Asn)是酶活性部位有关的氨基酸残基，若将其变成丝氨酸(Ser)，用65℃的失活半衰期衡量，从59分钟增到223分钟，酶的稳定性显著增加。 再如氧化失活使枯草杆菌蛋白酶在工业上的应用受到严重限制。 枯草杆菌蛋白酶在少量H2O2作用下很快失活是由于埋藏在催化部位Ser221邻近的Met222氧化成硫氢化物的原因。 1985年Wells证明若用其他氨基酸取代Met222，可以提高酶的氧化稳