分子生物學實驗上_1_2003.ppt

Vander Waal FORCE 凡得瓦爾力 是分子間微弱且短暫的吸引力，多發生在非極性的分子之間。? 繞在原子最外圍的電子依一定的軌道運轉，而此電子在軌道球面上的分佈通常是均勻的。當兩個原子漸漸接近時，這兩個原子上的電子會相互影響其分佈情形；若其中一個原子的電子分佈非常短暫地發生不均勻現象，則會導致短暫的偶極性產生 (d+．d-)，而這短暫的偶極性馬上誘導另一個原子上的電子，也產生電子分佈不均的現象，但偶極剛好相反 (d-．d+)。 這兩個相反的偶極，便可以產生極微弱且短暫的吸引力，即稱為凡得瓦爾力。 凡得瓦爾力的存在太短暫，因此很容易就散掉；為了達致最大的凡得瓦爾力，兩個原子核之間，要保持在一最適距離；太近則因電子相斥而減弱，太遠則電子間的吸引力又不夠。這個最適距離，即為該原子的凡得瓦爾半徑。 WHY NON-COVELANT BONDused in most bioactive molecules 二級鍵的能量都很弱，約只有共價鍵的百分之一到千分之一；因此，兩分子間若要以二級鍵形成有效的鍵結，就要增加其總鍵數。二級鍵的好處是，不用費太大的能量就可打斷，因此適合可逆性的作用模式。 ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 金屬螯合層析法 若在固相擔體接上金屬，則此金屬可被某些蛋白質所螯合，當洗去雜質後，即可純化出目標蛋白質。這類蛋白質分子中，多需要金屬做為 cofactor；也有特地在分子選殖時，加上一段可以與金屬結合的片段。 例如上例中，若在蛋白質端點接上一段含有六個 His 的片段，則此蛋白質可結合到接有金屬鎳的吸著劑。BCT 課程中的 GUS 已經接有這種 (His)6 的 tag，可以用金屬螯合法快速純化之。 STRATEGY for PROTEIN PURIFICATION ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? Determination the protein content of a single cells 0.5x105 Cells/tube 1x105 Cells/tube 2x105 Cells/tube Freezing thawing 3x cfg Lysis cells by adding 1mL lysis buffer Cell counting 0.8 mL sample + 0.2 mL BIORAD Dye OD595nm Interpolation with the Standard curve Protein content (pg/cell) Freezing cells Unit conversion Cfg, decant sup Material: 1.5mL eppendoff Cytometer+counter Lysis buffer (40cc): 20 mM Tris-HCl, [pH7.5] 1mM EDTA 20 微克/毫升 leupeptin 0.1mM PMSF 1mM DTT 0.5% Triton X-100 1000uL pipetteman x6 200uL pipetteman x6 Cells on flask Cells were trypsinzed In 10 mL PBS buffer Well-mixed, 1 drop was subjected to Hemacytometric assay 50, 60, 40, 50 cells in four 16-square corners. Under MS Q1: How many cells in the original cult