血小板膜糖蛋白αⅡbA477PA446P突变对αⅡbβ3复合物表达的影响.pdf

摘 要 13 血小板无力症是由于血小板膜糖蛋白aIIb3的基因缺陷引起 的血小板对多种诱聚剂的先天性、遗传性无聚集或反应减低。aIIb 133属于整联蛋白超家族的成员，整联蛋白是一组介导细胞黏附的受 体蛋白，具有相似的结构特征。为了明确血小板无力症患者的基因缺 陷，探讨其分子发病机理，了解特定位点的突变对QIIb133蛋白的 结构和功能影响，本论文对一例血小板无力症患者GT-57分子缺陷和 发病机理进行了研究。 IIb和133亚基基因的所有45个外 通过40对引物对GT-57的Q 显子及其剪接点进行了全长的PCR扩增，然后对PCR产物进行了 II b基因的14号和15号外显子 SSCP．聚丙烯酰胺凝胶电泳，发现Q 的PCR产物进行了直接测序，发现ⅡIIb基因外显子14发生了点突 IIb亚基 变G—C，导致氨基酸密码由GCT-CCT，该突变位于Q IIbA477P 变成脯氨酸(ⅡIIbA477P(A446P))，通过查阅文献资料，Q (A446P)突变系国内外第一例报道，为了进一步探讨该突变到底系 多态性位点?抑或是致病突变?如果是致病突变，该突变会对ctIIbp3 复合物表达产生怎样的影响?等等系列问题，我们进行了进一步深入 的研究。 II 本研究用重叠延伸PCR法对正常的Q b．pcDNA3．1+质粒载体 进行了体外定点诱变，并采用双酶切法将含突变的片段定向克隆至质 粒载体，并对Q 结果证实qII 生其他部位基因的突变及丢失。 我们用构建的突变Q 的ⅡII b-pcDNA3．1+和133一pcDNA3．1+质粒载体共转染实验为对照。 IIbl3 IIbA477P 本研究比较了转染后的真核细胞内Q 3基因和Q (A446P)B 3基因的表达情况的异同，从转录水平、蛋白质水平和 膜表面复合物水平检测了突变体在真核细胞内表达的基本情况。经体 II IIbA477P 外细胞转染实验后，RT-PCR显示正常的Qb和突变的Q (A446P)基因在真核细胞内有转录；免疫印迹实验显示细胞裂解物 内有Q IIbl3 仪检测结果显示，正常的Q 3阳性细胞率为77．89％，‘而突变Q II IIbA477P bA477P(A446P)B3阳性细胞率为10．09％，突变的a (A446P)13 IIb133复合 3复合物在细胞膜表面的表达量仅为正常C1 IIbB3复合物表达至细胞膜表面，导致了血小板无力症的发生 II b亚基的13一螺旋结构和最近发 TA等人发表的a 根据Springer 13 V 表整联蛋白Q 3的胞外