受体分析检查-检验核医学PPT.ppt

受体的放射性配体结合分析radioligand binding assay of receptors, RBA;受体（receptor）是细胞膜上或细胞内的一些能与生物活性物质相互作用并引起特异性生物效应的物质。 受体与其配体（ligand）结合后，通过受体特定的信号传导系统，引起细胞的特定反应，是高等动物适应环境、协调机体各种细胞功能的关键性分子。;受体的放射性配体结合分析（radioligand binding assay of receptors，RBA）是用放射性核素标记的配体与相应的受体进行特异性结合反应，从而对受体进行定性或定量分析。 ;定量RBA是在已知配体与受体反应的基础上，通过结合反应得知一定数量的组织或细胞与该放射性配体结合的受体数量，即结合位点数。配体与受体的亲和力以结合反应的平衡解离常数表示。 定性RBA则通过反应量效关系、某些参数的变化等判断受体的类型、结合方式（单位点系统或多位点系统）、受体与配体相互作用特点等。;一、RBA的主要优点;;2、核受体 受体在细胞核上，通过与细胞核内特定的DNA结合后影响遗传信息的转录。核受体一般是由400～1,000个氨基酸残基组成的可溶性单体蛋白质。氨基端是高度可变区，与转录的特异性有关。中间是DNA结合区，富含半胱氨酸，含有两个“锌指”结构，受体通过“锌指”与DNA结合；该区域部位保守性强。羧基端为激素结合区。 糖皮质激素受体类、性激素受体类、甲状腺激素受体类。;三、受体与其配基作用的特点;1．可饱和性 每个细胞所含的受体数目有限，故配体与受体的结合反应具有可饱和性，呈高亲和力和低容量。 2、可逆性 配体与受体的结合是可逆的，当受体周围配体浓度降低，结合反应就逆向进行，即配体与受体解离，解离后的配体是原形，不起代谢变化。;3、特异性和亲和力 受体有特异识别配体的作用，只有严格构型和构象的配体才能选择性地与某受体结合。受体的特异性还表现在器官或组织的专一性。受体的亲和力表明其与配体的结合能力，高亲和力说明受体配体结合牢固。平衡解离常数在10-9mol/L以上的被认为高亲和力受体。;4．生物效应的一致性 受体的主要功能是介导配体的生物效应，如一种蛋白质与某种物质结合而不介导特定生物效应，则此蛋白质不能称之为受体。 5. 需具有内源性配体 受体都需有内源性配体，如果通过外源性配体发现某种蛋白质分子具有类似受体的特性，但未找到内源性配体，则称之为孤儿受体，不能认为是真正的受体。;四、单位点系统RBA的基本原理; ?1=?1[R][L]， ?2=?2[RL] 平衡时：?1[R][L]= ?2[RL] 则平衡解离常数： KD=?2/?1=[R].[L]/[RL] KD是平衡解离常数,为平衡亲和常数KA的倒数，单位为mol/L，KD越大表示亲和力越低。 ;设受体和配体的初始浓度为[RT]和[LT],[R]=[RT-RL]，[L]=[LT-RL]，则： 经整理后得： [RL]2 — [RL][RT + LT + KD] + [RT][LT]= 0 对特定配体和某一固定量的特定受体，[RT]和KD均是定值，于是[RL]仅随[LT]而变，二者呈双曲线函数关系。 ;2、饱和曲线 简单单位点系统RBA应能得到典型的饱和曲线。以[RL]为纵坐标，[LT]为横坐标，得到[RL]随[LT]变化的曲线。配体的浓度从零开始上升时，复合物浓度先是上升很快，以后逐渐变慢，最后绝大部分受体都与配体结合，即受体饱和了。此就是饱和曲线。 饱和曲线趋向水平则说明大部分受体已与配体结合。;;（1）总结合（total binding，TB）;（2）非特异结合（non-specific binding，NSB）;（3）特异结合（specific binding，SB）;TB;五、离体RBA的基本方法 ;（一）基本试剂及制备;1、待测受体标本的制备 ;1）组织切片 为保持受体活性，常用冷冻组织切片，厚度5～50 ?m，将其贴于涂有明胶的玻片上，在温育缓冲液中与标记配体进行反应。反应后洗去游离部分。可刮下切片测量其放射性活度，也可用放射自显影或免疫组化研究受体分布。 ;2）完整细胞悬液的制备 血细胞可用通常分离血中有形成分的方法分离。 从组织中分离细胞一般是用胶原酶处理组织，再将游离的细胞分离出来。 用完整细胞进行RBA的主要优点是可同时观察配体与受体结合的情况和细胞的生物效应，得到的结果更能反映受体的生理特性。此外，还可直接给出平均每个细胞的受体数目。缺点是在处理过程中有时可能导致细胞表面生理活性的改变。有时受体在细胞中的含量很低，则需用较大量的细胞才能作一次实验。;3）细胞组分的分离