基因治疗（gene therapy）PPT.ppt

心血管病与肿瘤，传染病等不同，其发病过程较长，在发病的过程中存在一系列致病和抗病因素漫长的相互拮抗和调整的过程，是一系列网络调节失衡的结果。对于绝大多数的心脑血管病基因治疗的目的是促进自身的保护机制，阻断疾病发展过程中的恶性循环。 因此，对于绝大多数常见的心脑血管病的基因转移，不一定需要整合到染色体中，长期而终生表达，常常瞬间，有限的表达，阻断疾病的恶性循环即可达到治疗的目的。 心血管系统的基因转移 心血管系统的基因转移可分为间接细胞转移和直接基因转移两大类。 1.基因缝线： 基因缝线是一种裸DNA直接注射至体内的转移方法现在证明用裸DNA进行肌肉、血管和心肌直接注射，都可以实现局部组织的基因转移，并表达出相应的蛋白质。 基因缝线是将裸DNA通过多聚赖氨酸或鱼精蛋白直接黏附在手术缝合线上，进行肌肉、血管和心肌缝合。这种方法可以避免直接注射裸DNA后的流失，使其长期滞留在局部组织，发挥持续转基因作用。 这些病毒缺失了其自身复制所必需的一些基因，然后将治疗基因、一些基因的调控成分（如启动子和增强子）以及polyA信号等插入，使之成为表达性载体。目前在基因转移中所使用的病毒载体有以下几种。 1.逆转录病毒（retrovirus,RV） RV是目前基因转移中应用最为广泛的一类病毒。是一类RNA病毒。由于缺失了自身包装所必需的蛋白（结构蛋白gap，多聚酶pol，包膜糖蛋白env）基因，因此其复制需依赖辅助细胞系。逆转录病毒转染效率高，理论上可高达100%。 转染后，前病毒基因组（经反转录后形成的DNA）可与靶细胞基因组随机组合，因而能稳定的表达外源基因。 缺点：1）只能转染处于增殖状态的细胞；2）携带的外源基因不能太大（8-10Kb）； 3）逆转录病毒的感染依赖于靶细胞表面适宜受体存在，限制了它的应用，尤其是体内基因治疗的应用；4）理论上讲，从包装细胞释放出的复制缺陷的逆转录病毒只有一次性感染靶细胞，但在某种情况下也会造成野生型病毒的爆发。 5）由于病毒基因组是随机整合到靶细胞基因组的，因而具有致细胞癌变的可能；6）逆转录病毒不能耐受纯化和浓缩等处理过程，否则会使其感染活性大大下降。 逆转录病毒载体的构建 外源基因插入病毒基因组有两种方式，一种是直接将外源基因插入到病毒基因中；另一种是以外源基因取代病毒的必需结构基因。 在复制缺陷型病毒中，外源目的基因的插入使病毒基因灭火或以目的基因取代病毒的必需基因，使产生的重组前病毒不能表达病毒结构蛋白，因此转录产生的RNA不能被包装产生子代重组病毒， 必须借助辅助病毒的共感染或通过包装细胞提供病毒复制所必需的反式作用蛋白，然后才能包装产生子代重组病毒。这样获得的子代重组病毒仅仅具有一次感染性，避免了产生继发扩散感染的危险。 包装细胞（pakaging cell） 包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因gag、pol、env所编码的蛋白，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA，一句话，包装细胞本身不能产生任何形式的病毒颗粒。 逆转录病毒载体介导基因转移的一般过程： 1）目的基因克隆到逆转录病毒载体上；2）带有目的基因的逆转录病毒载体通过物理方法如磷酸钙介导或电穿孔法导入已选定的包装细胞； 3）根据载体所提供的筛选标记基因筛选转化细胞；4）选择具有高滴度重组病毒的转化细胞，分离重组病毒；5）重组病毒感染靶细胞，采用两种方式，一种是以无细胞带病毒上清和靶细胞一起温育；另一种以产病毒的包装细胞经射线照射致死后作为饲养细胞，被靶细胞在其上面培养达到目的。 6）如采用体外感染，则将感染的细胞回输体内，分析治疗基因的表达及治疗效果；7）病毒感染的质量控制，在基因转移过程中要进行严格的质量控制。 基因转移的方法和途径 逆转录病毒载体系统进行基因转移的方法主要有in vivo和ex vivo两种。基因治疗的早期多采用离体方案。离体方案基因转移效率高，具有明确的基因转移，但必须进行宿主细胞的体外分离培养，而大多数人体组织细胞，原代培养比较困难。 近年来，更多采用体内方案。重组逆转录病毒直接注射的途径主要有：1）采用静脉注射等途径，将重组病毒直接注射到机体内，通过重组病毒的感染作用实现基因转移；2）直接将产生重组逆转录病毒载体的包装细胞注射到组织或肿瘤中，由包装细胞释放再感染靶细胞； 3）直接将表达载体，可以是非病毒性表达质粒，注射到人体内，如将HIV-1病毒载体注射到肌肉内，使其表达相应的env基因蛋白，引起