γ-磷酸锆固定血红蛋白的研究.doc

γ-磷酸锆固定血红蛋白的研究 Immobilization of Hemoglobin on Layered γ-Zirconium Phosphate 摘要/Abstract 在γ-磷酸锆载体上成功地固定了血红蛋白，并对固定化的血红蛋白做了初步的表征。利用正交实验设计的方法系统地考察了预撑剂正丁胺的量、pH值、离子强度以及温度等各因素对固定化血红蛋白酶活性的影响。此外，还尝试了在固定化过程中加入惰性蛋白质牛血清白蛋白以提高固定化酶的活性。 In this study, we have successfully immobilized hemoglobin on layered γ-zirconium phosphate, and the immobilized hemoglobin was characterized. Taguchi method was used to design experiments to evaluate effects of concentration of butylamine, pH, ionic strength and temperature on immobilization behavior. We also attempted to add an inert protein, BSA, in the process of immobilization to increase the enzymatic action of the immobilized hemoglobin. 关键词：γ-磷酸锆，固定化，血红蛋白，正交实验设计，牛血清白蛋白 Key words: Layered γ-zirconium phosphate, Immobilization, Hemoglobin, Taguchi method, BSA 前言 酶是一种具有高效性和专一性的催化剂，但是在化学反应中直接使用游离的酶作催化剂有如下缺陷：游离酶的稳定性差容易失活；游离酶和产物不易分离，难以回收。这样酶的使用就受到了很大的局限。而固定在固体表面的酶则能够在很大程度上克服这种局限性。固定化酶有着及其重要的优点，首先它们保持了酶原有的高灵敏度和高选择性。其次固定化酶可以很容易与其产物分开，无残留，一方面使得产物易于纯化，简化了分析步骤，另一方面酶能够被回收重复利用因此也就降低了成本。更重要的是固定化可以克服酶容易失活，对有机试剂敏感等问题，从而使其稳定性大大提高。 近年来对酶等生物活性大分子固定化技术的研究主要注重于两个方面究。一是对固定化方法和机理的研究，主要有吸附法，共价法，交联法以及包埋法。第二点就是有关固定化载体的研究。总的来说，固定化载体应该能够防止酶的聚合和自发性降解，同时还应该在很大程度上保持酶的活性。如今一些常见的载体有高分子材料、溶胶、受控有机玻璃、Langmuir-Blodget膜、表面活性剂膜以及水凝胶等等.有实验研究表明，当蛋白质等试剂分子被固定于纳米级结构的载体上时，与固定在普通载体上相比，其选择性和稳定性会发生惊人的变化。 在各种各样的纳米材料中，有一种具有纳米级层间距的层状四价金属磷酸盐——磷酸锆一直是研究和应用的热点。磷酸锆有两种不同的结构类型（图1）：α-磷酸锆（α-Zr(HPO4)2·H2O，α-ZrP）和γ-磷酸锆（γ-Zr (PO4)(H2PO4)·2H2O，γ-ZrP）。γ-磷酸锆的每一层是由处于两个相互平行的平面上Zr原子，中间以PO43-和H2PO4-基团为桥梁紧密堆积而成，其中PO43-基团的四个氧原子与四个Zr原子共用，而H2PO4-基团与两个Zr原子共用2个氧原子，剩余的2个-OH基团指向层内空间。层与层之间的作用力是H2O分子和相邻两个层面上的=P(OH)2形成的氢键作用力，层间距为1.22nm，每个=P(OH)2基团周围的自由面积为0.36nm2。 图1. 两种层状磷酸锆的结构示意图，(a) α-ZrP, (b) γ-ZrP. γ-磷酸锆具有一些非常特殊的性质：（1）制备是从水溶液中得到，温度要求不高，所以制备简单，同时所得产品晶形好；（2）具有热稳定性和化学稳定性；（3）表面积和表面电荷密度大，是一种较强的固体酸；（4）可以配成悬浮液，也可进一步制成纳米颗粒重新分散于溶液介质之中以用于酶的固定化。 目前，γ-磷酸锆用于固定酶等生物活性大分子的研究报道还非常少。本论文研究的就是γ-磷酸锆固定血红蛋白的最佳条件选择。血红蛋白（Hemoglobin）是由Fe(II)和血红素b(作为辅基)和多肽链组成的一种结合蛋白，由四条多肽链(亚基)组成的四聚体，分子量大约为64500，等电点为pH6.9-7.3（不同的生物的血红蛋白等电点有细微差别）。血