免疫酶技术PPT.ppt

步骤：包被抗体A＋待测标本 ＋酶标抗体B ——洗涤，＋底物——终止液，观察结果 （检测Ag，Ag至少含A、B两个抗原表位） 该法是一次性加入标本和酶标抗体，试 验程序简单，提高了检测的特异性 用于检测Ag , 且Ag是具有至少2种抗原表 位的多价抗原 反应系统中固相Ab与酶标Ab的量相对于待测Ag是过量的，因此复合物的形成量与待测Ag含量成正比（在方法可检测范围内） （四）竞 争 法 步骤： 待测管：已知Ab包被＋待测标本（Ag？）—— 洗涤，＋酶标Ag——洗涤，＋底物——显色 先加 先加 （五）应用亲和素和生物 素的ELISA 亲和素(avidin)：糖蛋白，一分子由四个亚基组成，每一亚基可以与一分子生物素结合 生物素(biotin)：维生素H，可与蛋白质、糖类、酶类等结合，与亲和素特异结合后极稳定 亲和素 生物素 生物素 生物素 生物素 亲和素— 生物素在ELISA中使用： 三.ELISA结果的判定 （一）肉眼判定 与阳性、阴性对照颜色比较： 结果判定 2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判 定为阳性； 3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照 孔之间则判定为弱阳性。 1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性； （二）酶标光度仪检测A492值 （吸光率）：比色法 1.与阳性、阴性对照测定值比较 2.P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0 为阴性 P: positive（待测吸光度值） N: negative 四.ELISA试验的影响因素 （一）固相载体 常用固相载体材料：聚苯乙烯。其特点为吸附Ag或Ab的能力强，一但吸附后，不能被洗脱。 固相载体：酶标板 可分软、硬板 一次性使用，不可回收 酶标板要求： 吸附性能好、空白值低、透明度高 板批间、孔间性能相近 （二）抗原、抗体 Ag：需纯化 Ab：需效价高、亲和力强、纯化 （三）试验条件 1.包被： 一般用pH 9.6 CB(carbonate buffer)，0.05M, 有利于蛋白质吸附 包被浓度：0.1~100?g/ml，一般常用10 ?g/ml 包被时间、温度：4 ℃过夜或37 ℃ 1-3h 包被量：100ul 封闭：用0.1~5% 牛血清白蛋白缓冲液浸泡 0.5小时 2.抗原抗体反应的条件 （1）微碱性有利于抗原抗体结合，故用pH 7.4 PBS(phosphate buffer saline)洗涤 （2）去污剂有利于AgAb形成，洗液中加0.05% Tween-20 （3）Ag、Ab反应时间、温度： 一般 37℃、30~40min 3.洗涤 采用 PH7.2-7.4PBS洗涤，规一化，每次浸泡1~2min，拍干，共洗涤3~4次 4.酶促反应条件 温度 37℃ 时间 10min pH 5.5 底物量 一致 5.排除干扰：多设 对 照 ELISA试验应设对照 应设对照 操 作 应得结果 阳性对照 同标本一样 颜色深 阴性对照 同标本一样 颜色浅or无色 酶结合物对照 加酶步加入 无色 底物 对照 加底物步加入 无色 空白对照 只加终止液 无色 （以间接法为例，每孔均已包被Ag） 血清 100ul 酶标二抗100ul 底物100ul 终止液100ul 待测 待测 标本 血清 + + + 阳性 阳性 对照 血清 + + + 阴性 阴性 对照 血清 + + + 酶结合 物对照 PBS100ul + + + 底物 对照 PBS100ul PBS100ul + +