十一细胞色素ccytc的制备.ppt

实验六 细胞色素C（Cytc）的制备 一、目的要求 1.学习蛋白质制备的基本原理及方法。 2.学习和掌握制备细胞色素C的方法。 二、原理 细胞色素C存在于线粒体中，是唯一较容易从线粒体中提前出来的蛋白质。先向心肌中加入低浓度三氯乙酸溶液（TCA），一起匀浆，由于细胞色素C是碱性蛋白，低浓度的TCA可使其酸化，易于从膜上溶解下来，而其它的大部分蛋白质都被TCA沉淀下来。再通过硫酸铵沉淀肌红蛋白，最后用较高浓度的TCA使细胞色素C沉淀出来，达到初步纯化的目的。 三、材料、试剂与器材 材料：猪心 试剂： 20% TCA、 0.145 mol/L TCA、硫酸铵、10% NaOH 器材：组织捣碎机 、离心机、磁力搅拌器 四、离心机的使用 (1).离心机要置水平位置,以保证旋转轴垂直地球水平面。 (2).使用前应检查套环是否平衡。 (3).离心杯及其外套(离心管套)是否平衡。 (4).样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡，平衡后把它们放置于转子的对称位置。 (5).盖好盖子,打开电源开关,调整离心时间。 (6).启动离心时转速应由小至大,缓慢升速(一般要2~3min)。 (7).达到预定转速后再调整离心时间至预定时间。 (8).离心完成后要调整调速连杆至零位,同时关上电源。 (9).要等到转速为零时才能打开离心机盖,取出样品。 五、操作方法 新鲜猪心50 g，切碎，加等量0.145 mol/L TCA，高速组织捣碎机匀浆2min。使cytc从线粒体膜上解聚下来。 用6层纱布过滤匀浆液去杂质。并于室温放置抽提3小时。 用10％ NaOH溶液将上述混合液调pH值至7.3，并测定体积。 ——以利于（NH4）2SO4沉淀去杂蛋白 按500 g/L混合液缓慢加入（NH4）2SO4粉末，边加边搅拌。放置一段时间，4000 r/m离心20 min去除沉淀，得到粉红色滤液，测定体积。 进一步按50 g/L滤液缓慢加入（NH4）2SO4粉末，边加边搅拌。放置一段时间，4000 r/m离心20 min去除沉淀，得到粉红色滤液，测定体积。 加入20%TCA（25 mol/L上清）—沉淀cytc。3000r/m离心15 min得到沉淀。 7.用1 mL蒸馏水溶解沉淀，将此悬浮液移入透析袋，透析至无（NH4）2SO4和TCA。 8.透析后的细胞色素C溶液4000 r/min离心20 min去除沉淀，得到粉红色滤液。 六、注意事项 1.加入（NH4）2SO4时要先将其磨成粉末，再缓慢地边搅拌边加入。 2. 10％NaOH溶液调混合液pH值至7.3时，一定不能调过头，否则细胞色素C易变性。 3.透析时要求低温，透析袋要避免破漏，每隔几小时要换透析液，并用Ba2+检查是否还有SO42－存在。 七、思考题 1.为什么用0.145 mol/L TCA来抽提细胞色素C？ 2.加入硫酸铵时要注意什么？为什么？ * *