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发酵产品---干扰素 干扰素概述 1 生产干扰素的菌种 2 发酵工艺过程 3 发酵过程控制 4 分离纯化过程 5 干扰素？ 干扰素的价值 干扰素应用前景 干扰素是一种细胞因子，是目前所知机体发挥抗病毒作用最快的第一病毒防御体系，具有广谱的抗病毒作用；抑制病毒感染、阻止病毒在体内扩散、促进痊愈；调节免疫功能；抑制肿瘤细胞生长等作用。 干扰素概述 1 生产干扰素的菌种 2 发酵工艺过程 3 发酵过程控制 4 分离纯化过程 5 菌种来源: 重组人干扰素α-2b 工程菌是由带有人α-2b 干扰素基因的重组质粒[pVG3]转化腐生型假单孢杆菌（pseudomonass putida VG-4）菌种而来 菌种的特性 细胞形态：革兰氏阴性，可运动，有荚膜，无芽孢，杆状 菌落特征： 灰绿色半透明状。菌落之间结构相同，具有黏稠性 生化特性：菌株为苏氨酸营养缺陷型，可以利用L-缬氨酸、DL-精氨酸和L-苏氨酸作为碳源 遗传特性：细胞中携带pVG3质粒，对氨苄青霉素有抗性 生产能力： 具有生产干扰素a - 2b的能力 干扰素概述 1 生产干扰素的菌种 2 发酵工艺过程 3 发酵过程控制 4 分离纯化过程 5 干扰素α-2b的发酵工艺过程： 取保存工作种子批菌种，室温融化 摇瓶培养：30℃，pH7.0，250 r/min，18±2h 检测：OD值和发酵液杂菌检查。 1.接种：接入50L种子罐，接种量10%。 2.培养：30℃，pH7.0。 3.控制：级联调节通气量和搅拌转速 4.DO为30%，3～4h，OD4.0。 5.检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。 1.接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。 2.控制：级联调节通气量和搅拌转速。 3.前4h：30℃，pH7.0，DO为30%。 4.4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。 5.终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降温至15℃以下。 6.检测：发酵液杂菌检查 连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。 菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。 干扰素概述 1 生产干扰素的菌种 2 发酵工艺过程 3 发酵过程控制 4 分离纯化过程 5 发酵中菌体生长与干扰素合成的关系 培养基组成 溶解氧 温度 pH值 发酵过程中泡沫的形成与控制 (1)发酵中菌体生长与干扰素合成的关系 在假单胞杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5h分裂速度最快，到3.5h开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5h之后，在4h达到最大，然后由于降解而迅速下降。可见在发酵生产工艺中，假单胞杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态。 (2)培养基组成 种子培养基的营养成分宜丰富些，尤其是氮源的含量应较高(即C/N低)。相反，对于发酵培养基，氮源含量应比种子培养基稍低(即C/N高)。 (3)溶解氧 基因工程菌发酵要求培养液中有足够的溶解氧，为了提高发酵罐的供氧能力，往往需要增大搅拌转速，增加空气流量，或通入纯氧 (4)温度 对于采用温度控制基因表达或质粒复制的基因工程菌。发酵过程一般分为生长和表达两个阶段。 (5)pH值 采用两段培养法，在生长和生产阶段分别控制在各自最佳pH值，对提高干扰素的发酵水平非常有利。可在发酵后期降低pH值，从而造成大量蛋白酶失活，减少干扰素的水解，提高干扰素的积累量。 (6)发酵过程中泡沫的形成与控制 气泡内的空气有隔热作用。造成培养及灭菌不彻底。泡沫多时会从排气口甚至从轴封中溢出容易造成染菌。一般应通过机械搅拌和加大少量表面活性剂来消除泡沫。 干扰素概述 1 生产干扰素的菌种 2 发酵工艺过程 3 发酵过程控制 4 分离纯化过程 5 干扰素α-2b分离工艺过程 菌体裂解 预处理 初级分离 菌体裂解 裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5） 使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎-20℃菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃ 冻融: 细胞完全破裂，释