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发酵产品---干扰素PPT
发酵产品---干扰素 干扰素概述 1 生产干扰素的菌种 2 发酵工艺过程 3 发酵过程控制 4 分离纯化过程 5 干扰素? 干扰素的价值 干扰素应用前景 干扰素是一种细胞因子,是目前所知机体发挥抗病毒作用最快的第一病毒防御体系,具有广谱的抗病毒作用;抑制病毒感染、阻止病毒在体内扩散、促进痊愈;调节免疫功能;抑制肿瘤细胞生长等作用。 干扰素概述 1 生产干扰素的菌种 2 发酵工艺过程 3 发酵过程控制 4 分离纯化过程 5 菌种来源: 重组人干扰素α-2b 工程菌是由带有人α-2b 干扰素基因的重组质粒[pVG3]转化腐生型假单孢杆菌(pseudomonass putida VG-4)菌种而来 菌种的特性 细胞形态:革兰氏阴性,可运动,有荚膜,无芽孢,杆状 菌落特征: 灰绿色半透明状。菌落之间结构相同,具有黏稠性 生化特性:菌株为苏氨酸营养缺陷型,可以利用L-缬氨酸、DL-精氨酸和L-苏氨酸作为碳源 遗传特性:细胞中携带pVG3质粒,对氨苄青霉素有抗性 生产能力: 具有生产干扰素a - 2b的能力 干扰素概述 1 生产干扰素的菌种 2 发酵工艺过程 3 发酵过程控制 4 分离纯化过程 5 干扰素α-2b的发酵工艺过程: 取保存工作种子批菌种,室温融化 摇瓶培养:30℃,pH7.0,250 r/min,18±2h 检测:OD值和发酵液杂菌检查。 1.接种:接入50L种子罐,接种量10%。 2.培养:30℃,pH7.0。 3.控制:级联调节通气量和搅拌转速 4.DO为30%,3~4h,OD4.0。 5.检测:显微镜和LB培养基划线检查,控制杂菌。 1.接种:通入300L培养基的发酵罐,接种量10%。 2.控制:级联调节通气量和搅拌转速。 3.前4h:30℃,pH7.0,DO为30%。 4.4h后:20℃,pH6.0,DO为60%,5~6.5h。 5.终点控制:OD值达9.0±1.0,5℃冷却水快速降温至15℃以下。 6.检测:发酵液杂菌检查 连续流离心机:冷却的发酵液,16000 r/min离心收集。 菌体保存:-20℃冰柜,不超过12个月。 检测:干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。 干扰素概述 1 生产干扰素的菌种 2 发酵工艺过程 3 发酵过程控制 4 分离纯化过程 5 发酵中菌体生长与干扰素合成的关系 培养基组成 溶解氧 温度 pH值 发酵过程中泡沫的形成与控制 (1)发酵中菌体生长与干扰素合成的关系 在假单胞杆菌的发酵生产中,菌体在培养1.5h分裂速度最快,到3.5h开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5h之后,在4h达到最大,然后由于降解而迅速下降。可见在发酵生产工艺中,假单胞杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态。 (2)培养基组成 种子培养基的营养成分宜丰富些,尤其是氮源的含量应较高(即C/N低)。相反,对于发酵培养基,氮源含量应比种子培养基稍低(即C/N高)。 (3)溶解氧 基因工程菌发酵要求培养液中有足够的溶解氧,为了提高发酵罐的供氧能力,往往需要增大搅拌转速,增加空气流量,或通入纯氧 (4)温度 对于采用温度控制基因表达或质粒复制的基因工程菌。发酵过程一般分为生长和表达两个阶段。 (5)pH值 采用两段培养法,在生长和生产阶段分别控制在各自最佳pH值,对提高干扰素的发酵水平非常有利。可在发酵后期降低pH值,从而造成大量蛋白酶失活,减少干扰素的水解,提高干扰素的积累量。 (6)发酵过程中泡沫的形成与控制 气泡内的空气有隔热作用。造成培养及灭菌不彻底。泡沫多时会从排气口甚至从轴封中溢出容易造成染菌。一般应通过机械搅拌和加大少量表面活性剂来消除泡沫。 干扰素概述 1 生产干扰素的菌种 2 发酵工艺过程 3 发酵过程控制 4 分离纯化过程 5 干扰素α-2b分离工艺过程 菌体裂解 预处理 初级分离 菌体裂解 裂解缓冲液:纯化水配制,2℃~10℃(pH7.5) 使用保护剂:EDTA,PMSF。 破碎-20℃菌体:2厘米以下的碎块 搅拌:加裂解缓冲液,2℃~10℃ 冻融: 细胞完全破裂,释
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