Braf基因突变检测试剂盒说明书.pdf

人类B-raf 基因V600E 突变检测试剂盒（荧光PCR 法）说明书 【产品名称】 通 用 名：人类B-raf 基因V600E 突变检测试剂盒 （荧光PCR 法） 英 文 名：Diagnostic kit for V600E Mutation of Human B-raf Gene (Fluorescence PCR Analysis) 【包装规格】 20 测试/盒 【预期用途】 B-raf 基因位于7 号染色体长臂上，是一种癌基因，属RAF 基因家族，有18 个外显子，编码一种含783 个 氨基酸的B-raf 蛋白，是EGFR 通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK 中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分 化和凋亡等多种生理过程。 针对EGFR 的肿瘤靶向药物通过抑制该途径发生药理作用。研究表明在非小细胞肺癌、结直肠癌等多种恶 性肿瘤中存在B-raf 基因突变，其中第15 外显子上V600E 点突变最常见，约占所有突变的90% 以上，该突变导 致B-raf 蛋白被异常激活，从而使患者接受EGFR-TKI 药物和EGFR 单抗类药物治疗失效。据中国2010 版《肿 瘤学临床实践指南》建议，对K-raf 基因检测正常的非小细胞肺癌和结直肠癌患者，应进一步检查B-raf 基因的 突变状态，以指导靶向药物治疗方案。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA 为检测样本，用于肿瘤组织B-raf 基因 V600E 点突变的定性检测，为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供依据。本公司尚无临床实例证实B-raf 基因突变与靶向药物的相关性，其相关性主要来自文献报道，因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对肿 瘤患者制定用药方案。 【检验原理】 本试剂盒基于实时荧光PCR 平台，结合等位基因特异性扩增 （ARMS ）技术、野生型基因扩增抑制技术和 多重PCR 技术检测B-raf 基因V600E 突变。ARMS 技术是指PCR 引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA 互补 才能有效扩增，通过设计特异性ARMS 引物，对存在V600E 突变的B-raf 基因靶序列进行PCR 扩增放大，并 利用FAM 基团标记的Taqman 探针对扩增产物进行检测。因为采用了野生型基因扩增抑制剂，使ARMS 体系 能够耐受更高浓度的背景野生型B-raf 基因，降低了试剂盒对基因组样本的DNA 浓度要求，提高了检测灵敏度。 为质控扩增体系的有效性，试剂盒设置了内质控和外质控，内质控基因是人类基因组的一个保守片段，长 度与B-raf 目标片段相似，均为100bp 左右，内控探针采用标记ROX 基团的Taqman 探针对内控基因扩增产物 进行检测。内控引物、探针及内控基因对ARMS 体系的扩增效率无影响。阳性对照品是B-raf 基因V600E 突变 质粒与野生型人类基因组DNA 的混合物，用于PCR 扩增的外质控。 【主要组成成份】（20 次检测） 本试剂盒包含PCR 反应液I、PCR 反应液Ⅱ和阳性对照品等3 管试剂。PCR 反应液I 体积350μl，包含相 应的B-raf 基因突变和内控检测引物和探针，V600E 突变探针由FAM 荧光指示，内控探针由ROX 荧光指示。 PCR 反应液I 包含一对B-raf 基因V600E 突变检测引物和一对内控引物、标记FAM 基团的用于检测突变 B-raf 基因的 Taqman 探针和标记 ROX 基团的用于检测内控基因的 Taqman 探针，各引物和探针浓度均为 20-100pM；野生型基因扩增抑制物，浓度为1200pM； PCR 反应液Ⅱ体积100μl，包含0.1U/μl Taq 酶和50nM dNTP、750nM Mg2+ 等； 阳性对照品体积 20μl，包含 300copies/μl 的B-raf 基因 V600E 突变质粒和 10ng/μl 的野生型人类基因组 （3000copies/μl） 检测必须但试剂盒中不包含的组分： 1.5ml 离心管（用于配制PCR 反应液和DNA 提取）； 0.2ml PCR 管或8 联PCR 管或96 孔PCR 板； 带滤塞的吸头（1ml、200μl 和10μl）； DNA 提取试剂盒ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System （货号：A2352 ） 【贮存条件及有效期】 置于-20 ℃条件下储存，有效期6 个