绪 论,基因工程.docx

绪 论基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术.二、基因操作（Gene manipulation）强调：外源核酸分子（一般为DNA）在不同宿主中的繁殖 打破自然种的界限，将来自不相关物种的基因放入一个宿主中基因操作的重要特征：基因转移 繁殖概念的延伸：个体内部基因的增加（knock in）或减少（knock out）了解对基因的研究是如何实施的:除了包括基因克隆（gene cloning）外,还包括基因的表达（expression）、调控（regulation）、检测（detection）和改造（modification）等与基因研究相关的内容.基因工程的发展史： 基因工程准备阶段：1944，美国Avery证明DNA是基因载体1953，WatsonCrick建立DNA双螺旋模型1954—1971，中心法则的确立，密码子的破译1960—1970’s，限制酶连接酶的发现1972，第一个重组DNA分子的构建基因工程诞生：1973，Cohen Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化基因工程的迅速发展阶段：一系列新的基因工程操作技术的出现；各种表达克隆载体的成功构建；一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现一、基因的基本概念基因是遗传信息的基本单位，从物质结构上看，基因是染色体组核酸分子基因是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段，可以是连续的，也可以是不连续的，可以是DNA也可以是RNA，可以存在于染色体上，也可以存在于染色体之外（如质粒、噬菌体等）。1.基因及其产物的共线性2.基因及其产物的非共线性3.基因的重叠与可变性二、基因的基本结构组成编码区（ORF）启动子 （promoter） 核糖体结合位点（RBS） 终止子 （terminator） 侧翼序列 （flanking sequence） Cap/Tail亚克隆（subcloning）：初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，在诸如表达序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”。第二章　分子克隆工具酶第一节 限制性内切酶概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶命名：以提取这类酶的生物的属名和种名的第1、2个字母以及菌株代号来命名。二、限制性内切酶识别的序列概念：限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列。三、限制性内切酶的切割位点概念： DNA在限制性内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置，用↓或/表示。粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。 了解同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如： BamHI和BstI均可识别GGATCC。同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如： TaqI：TCGA；ClaI：ATCGAT；AccI：GTCGAC四、酶切反应系统1：底物DNA限制性内切酶的底物是双链DNA分子,作用位点在识别序列上,其催化效率与DNA样品纯度、ＤＮＡ分子构型、识别序列长短以及识别序列碱基甲基化等密切相关。2：限制性内切酶用量取决于酶本身催化活性和底物ＤＮＡ样品。 1酶活性单位（unit/Ｕ）：60min内完全切割1μg λDNA所需的酶量。容积活性（U/ μl ）：1μl 酶液中具有的酶活性单位。3:限制性核酸内切酶反应缓冲液缓冲液中应含有氯化镁或醋酸镁、氯化钠或醋酸钾、二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇、Tris-HCl或Tris-Ac。4:限制性核酸内切酶反应温度:多数限制性核酸内切酶的最适反应温度为37 ℃ ，少数例外，如：AcyI： 50 ℃；ApaI ：30 ℃；BstNI：60 ℃ ；TaqI：65 ℃ 等。星星活性（Star activity） 某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 Star活性出