第三章 动物细胞工程制药45节.ppt

a 台盼蓝染色： 台盼蓝（Trypan Blue，也称Direct blue 14） 一种死细胞染色用色素化学名：3,3’-{[3,3’-二甲基-(1,1’-二苯基)-4,4’-二基]双(偶氮)}-双(5-氨基-4-羟基-2,7-萘二磺酸)，四钠盐分子式：C34H24N6Na4O14S4分子量：960.81外观：黑褐色结晶粉末摩尔吸光度：69,000(在606nm附近) 染色原理：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性， 通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数 台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可 台盼蓝染色的一些注意事项： 1. 台盼蓝对人体有毒 2. 台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数 3. 台盼蓝染色法对于悬浮细胞来说，还比较方便，对贴壁细胞来说，较为繁琐。因为要消化，有时，96孔板不一定能消化干净。而且，该法是测定细胞浓度的方法，与细胞悬液的体积有关，加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。可以说，该法相对准确，可能有一些人为因素的干扰 b 苯胺黑 染色 俗称阿尼林黑或精元。一种直接在棉织物上生成的、不溶于普通溶剂的黑色染料 染色时细胞悬液与染液比例同台盼蓝，稍放置后即可镜检 ③结晶紫染色细胞核计数： 原理：结晶紫具有低渗，并有鳌合钙离子的作用，因此可以使细胞分散解离和破碎，细胞核染成蓝色 该法最经常使用于微载体细胞培养中 ④四氮唑盐（MTT）染色计数法 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将MTT黄色溶液还原成不溶性的蓝紫色结晶物，并沉积于细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）和酸化的异丙醇或酸化的SDS等均能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪，在490nm波长处测定其光吸收值（OD），可间接反映活细胞数量。在一定细胞数值范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。 此法已广泛用于生物活性因子的活性检测、细胞毒性实验、抗肿瘤药物筛选和肿瘤放射敏感性测定等 3 细胞培养时活细胞的观察检测 ① 活细胞的观察检测方法 肉眼观察 相差显微镜观察 细胞在体外培养过程中需要每天观察，以便及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄、是否更换等。 细胞常规检查的方法为： （4） 无机盐 无机盐的作用是保持细胞的渗透压，缓冲pH的变化，并积极参与细胞的代谢 一般合成培养基中加入NaCl、KCl等，用以维持细胞的渗透压和缓冲pH的变化 另外，加入 CuSO4,ZnSO4等，用以促进细胞的代谢 二、动物细胞培养基的种类和组成 上述合成培养基中主要有氨基酸、维生素、糖类、无机盐以及其它一些特定成分如核酸的前体腺苷、鸟苷等 为了给细胞培养以更大的方便，以便于其增殖或贴附生长，常培养基中加入一定量的动物血清，常用的是添加5%~10%的小牛血清，杂交瘤细胞的培养中，血清可能要求的更高，常用10~20%的胎牛血清 培养用血清 血清的作用机制可能为： （1）提供有利于细胞生长增殖所需要的各种生长因子和激素 生长因子：胰岛素、表皮生长因子、成纤维细胞 生长因子 激 素：皮质醇、雌二醇、黄体酮、甲状腺素 （2）提供有利于细胞贴壁所需要的贴附因子和伸展因子 贴附和伸展因子：纤维结合蛋白、软骨素、 昆布氨酸、胶原 （3）提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白 结合蛋白可与维生素、脂质和激素结合，并将它 们带入细胞 铁传递蛋白可结合传递铁离子 它们还可以清除某些毒素和金属的毒性作用 （4）提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素 脂肪酸中有磷脂质、胆固醇和前列腺素E等，它们可能与其他的生长因子相结合后起作用 微量元素中有铜、锌、钴、钼、硒等，它们对酶有激活作用，并可保护自由基对DNA的损害 二、动物细胞培养基的种类和组成 3、无血清培养基 无血清培养基的优点如下：①提高了细胞培养的可重复性，避免，避免了由于血清批之间差异的影响；②减少了由