第三章 生物技术药物工艺.ppt

第三章 生物技术药物的工艺研究 目的基因的获得与分析 表达载体构建与分析 工程菌（株）的构建与分析 发酵（培养）工艺与质控 分离纯化工艺与质控 制剂处方、工艺与质控 模仿生产条件下的工艺与质控 上游研究 下游研究 中试研究 药理、毒理、临床、稳定性 第二节 生物技术药物的下游研究 发酵（培养）工艺研究 分离纯化工艺研究 制剂处方与工艺研究 一、发酵（培养）工艺研究（1） 一、发酵（培养）工艺研究（2） 培养基组成与pH值 基础培养基、诱导培养基 培养参数 温度、 pH值、溶解氧 生长曲线 纵坐标：生物量（干重/体积、湿重/体积、细 胞密度） 横坐标：培养时间（小时） 一、发酵（培养）工艺研究（3） 小规模表达研究 *表达曲线 纵坐标：产物浓度、活性单位/体积 横坐标：培养时间（小时） *目的 初步确定表达诱导培养参数、诱导时机、诱导时长、终止时机 一、发酵（培养）工艺研究（4） 放大培养与表达研究 菌种（细胞）活化：培养条件、 培养时间 种子液：培养条件、 培养时间、接种时机、接 种量、质量控制 生长相：培养基与培养参数控制 生产相（蛋白质）：培养基、参数控制、诱导 时机、表达曲线、收获时机 二、蛋白质分离纯化研究 分离纯化原则 分离策略 粗纯 色谱技术与精纯 （一）、分离纯化原则 要建立一个方便灵敏的蛋白检测方法，以估价每一步的提纯程度； 分离步骤要尽可能少； 初步分离要快速，精纯要高分辨率； 尽可能避免带入有害物质; 每步需统计： 得率、纯度、纯化倍数 （二）、分离纯化策略 （三）、粗纯 固液分离 胞内表达 分泌表达 菌体 包涵体 裂解液 复性液 上清 粗提液 捕获目的产物 破菌、离心、洗涤 柱层析/沉淀/超滤 裂解：尿素、盐酸胍 复性：稀释、柱复性 （四）色谱技术与精纯 精纯的主要目的： 除宿主来源DNA 除宿主来源蛋白质 除宿主来源内毒素或致病因子 除目的产物的异构体 常用色谱分离技术 离子交换层析（IEX） 疏水作用层析（HIC） 分子排阻层析（GF，SEC） 亲和层析（AC） 反相色谱层析（RPC） 离子交换过程 1 阳离子交换剂： Exch-X+ Exch- +X+ Exch-+Pro+ Exch-Pro+ 2 阴离子交换剂： Exch+ X - Exch++X- Exch+ +Pro- Exch+Pro- Mini Q PC 3.2/3: Glutathione synthetase SDSStarting material Peak 2 30μm 15μm 5μm Influence of Particle Size on the Separation effect 疏水层析（HIC） A 280 0.04 AU Na2SO4 1.0 M 疏水层析操作 凝胶过滤色谱原理图 Desalting proteins proteins salts 螯合亲和层析Metal Chelation Chromaography(MCC) 通过络合或螯合基团将过渡金属Zn、Ni、Cu、Co等的二价离子固定在载体表面； 对含色氨酸或组氨酸序列有亲和力； 以pH值和离子强度的改变来洗脱； (His)6已广泛用于重组蛋白的分离。 反相液相色谱Reversed Phase Chromatography（RPC） 反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求 通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性 RPC 载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20 μm ） 固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质 C18适于分离核酸 流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃 （四）精纯（1） （四）精纯（2） 2-3步柱层析：离子交换（IEX）、疏水 （HIC）、凝胶过滤（GF） 尽量避免采用亲和层析（AC） 尽量避免采用反相层析（RPC） 除细菌内毒素用阴离子交换（AEX）