第三章_基因克隆2.ppt

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第三章_基因克隆2

第三章 基因工程载体;噬菌体的一般生物学问题;; 噬菌体的核酸,最常见的是双链线性DNA。除此之外,还发现有双链环形DNA、单链环形DNA、单链线性DNA以及单链RNA等多种形式的噬菌体。不同种噬菌体之间,其核酸的分子量相差可达上百倍。情况往往是,具有大分子量核酸的噬菌体,其生命周期就比较复杂,而且在它们的复制过程中,对于寄主细胞酶分子的依赖性也较低。; 有些噬菌体的DNA碱基并不是由标准的A、T、G、C四种碱基组成。例如,T4噬菌体DNA中就没有C碱基,取代的是5-羟甲基胞嘧啶(HMC);SPOl噬菌体DNA中没有T碱基,代之以5-羟甲基尿嘧啶(HMU)。 ; 噬菌体的感染效率高到令人生畏的地步。一个噬菌体颗粒感染了一个细菌细胞之后,便可迅速地形成数百个子代噬菌体颗粒,而每一个子代颗粒又各能够感染一个新的细菌细胞,再产生出数百个子代颗粒,如此只要重复四次感染周期,一个噬菌体颗粒便能够使数十亿个的细菌细胞致死。 ;;噬菌体的溶源生命周期 溶源生长周期: 是指在感染过程中没有产生出子代 噬菌体颗粒,噬菌体的DNA是整 合到寄主细胞染色体DNA上,成 为它的一个组成部分。 现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期 ;温和噬菌体:既能进入溶菌生命周期又能进入溶 源生命周期。 溶源性细菌:具有一种完整的噬菌体基因组的细菌 溶源化: 用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶 源性细菌的过程 整合: 噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体 DNA中 原噬菌体:在溶源细菌内存在的整合的或非整合的 噬菌体 超感染免疫性:溶源性细菌不能够被头一次感染并 使之溶源化的同种噬菌体再感染。 ;超感染免疫:抗御同种噬菌体再感染的特性。(λ噬菌体的超感染免疫性,具有一种阻遏-操纵体系) 溶源性细菌的诱变:经过许多世代之后,溶源性细菌便能够开始进入溶菌周期。 ; 现在对于λ噬菌体的超感染免疫性现象已有相当深刻的了解,它具有一种阻遏-操纵体系。阻遏基因cI编码的阻遏蛋白,与两个分别同启动基因PL和PR相邻的操纵基因OL和OR结合。; 在溶源性细菌中,cI阻遏基因编码的阻遏物能够持续地合成,而且它的产量就其操纵基因而言是略为超量的。由于阻遏物分子同OL和OR,这两个操纵基因位点相结合,这样RNA聚合酶便无法使用PL和PR,这两个启动子进行转录,因此在溶源性的细菌中,从这两个早期启动子开始的转录是被抑制的。下面我们将会看到,这种状态有充分的能力使原噬菌体保持关闭的形式,这就是溶源性细菌能够不停地生长而不发生溶菌裂解的原因所在。; 如果λ噬菌体感染了正常的细菌细胞,那么加入进来的λDNA分子的这两个操纵基因将是空闲的,即没有结合上阻遏物分子,因为此时噬菌体的阻遏物尚未合成出来,所以将会发生转录作用。但是,如果一个噬菌体尝试感染一个溶源性细菌,由于在溶源性细菌中早已存在的超量的阻遏物分子,在RNA聚合酶同PL和PR位点结合之前,便会同感染进来的λDNA分子的这两个操纵基因相结合。这种被阻遏物分子结合着的操纵基因,阻止λ噬菌体发育成溶菌状态,我们称这种抑制作用为对同源免疫超感染的抗性。 ; 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物,能高效率高特异性地侵染宿主细胞,然后或自主复制繁殖,或整合入宿主基因组中潜伏起来,而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体,因为:高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。 ;λ噬菌体载体 ;性质;2 在寄主范围方面,较质粒载体要狭窄得多,也就更安全。 ;;4 将λ噬菌体基因组人为地划分为三个区域:左侧区包括使噬菌体DNA成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因,全长约20kb。右侧区内包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因,这个区域约长12kb。中间区域约长18kb, ;(l)左侧区段自基因A到基因J ,分布在基因组左臂,约占1/3基因组。包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成及装配所需要的全部基因。参与噬菌体头部蛋白质合成的有W、B、C、D、E、F等多种基因,参与尾部蛋白质合成的有Z、U、V、G、H和M、L、K、I、J等10余种基因。; (2)中间区段介于基因J与基因N之间,约占λDNA的1/3。包括功能不清的b2区(J

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