第二章 生物制药技术与单元操作.ppt

2　生物制药技术与单元操作;2.1 基因工程技术;1966年，发现了DNA连接酶。1970年Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性内切酶 Hind Ш，使DNA分子的切割成为可能。1979年，Bltimore和Temin领导的两个研究小组分别在各自的工作中发现了逆转录酶。;1972年，美国斯坦福大学博格（Berg）研究小组利用限制性内切酶EcoR I 和T4 DNA连接酶成功地进行了首例体外基因重组实验。;1973年，科恩（Cohen）等人用EcoR I内切酶处理大肠杆菌的抗四环素和抗青霉素及磺胺的质粒，并连接成一个新的重组质粒。将这种工程化的质粒转入到大肠杆菌中，在含有四环素和青霉素的平板中筛选到了重组菌落。 同年，加利福尼亚的博耶（Boyer）也进行了类似的实验。 重组子转化的成功标志着基因工程的诞生。 ;　　　　基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法， 按照人类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并能使 之稳定地遗传给后代。 ;1．直接从染色体DNA中分离： 仅适用于原核生物基因的分离，较少采用 2．人工合成 　根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。 3.从mRNA合成cDNA 采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA） 4．从基因文库中筛选 5．利用PCR合成＊ ;;以生物体的RNA序列为模板，经反转录形成cDNA分子，再予以克隆。由于用以克隆的cDNA分子通常只有几个kb大小，所以很适合用质粒作载体。 构建cDNA文库的程序：（1）制备含有polyA的RNA；（2）cDNA的合成；（3）cDNA与载体的连接；（4）转化。cDNA与载体分子形成重组分子后，转入受体菌株（如大肠杆菌），当不同的重组分子含有不同的基因时，整个转化子含有来自mRNA群体的各种cDNA基因，这个转化子群体构成了该mRNA全部遗传信息的cDNA基因文库。 ;;ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC;ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC; 表 琼脂糖浓度与DNA分离范围;琼脂糖凝胶电泳的操作过程;;; 荧光染料EB染色的原理;2.1.2 基因克隆的酶学基础;2.限制性核酸内切酶的命名原则 1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原则，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类 ①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus);第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。 ②第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。 ③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。;限制性核酸内切酶的命名原则： 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 HindⅡ HindⅢ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶;3.限制性核酸内切酶的分类 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。;4.Ⅱ限制性核酸内切酶的功能 Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有180°的旋转对称性即回文结构。Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。 ;;;;;Ⅱ型核酸内切酶的基本特征;5.II型限制性核酸内切酶酶切反应操作 ◆大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件： Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-100mmol/L DTT 1mmol/L Volume 20-100μL Temperature 37℃ Time 1-1.5h ◆1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20μL反应液中反应1h，使1μg标准DNA完全消化所需的酶量。;6.Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途 ①在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。 ②建立DNA分子的限制酶图谱。