第五章分子生物学研究方法(上)——生物大分子操作技术ppt.ppt

* 南京农业大学 生命科学学院 * 第二节 DNA操作技术 4. 基因组DNA文库的构建 从生物组织细胞提取出全部DNA将其切成预期大小的片段，分别与载体连接，转入受体细菌或细胞，形成克隆。这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库。 基因组DNA文库可用于分离特定的基因片断、分析特定基因结构、研究基因表达调控、还可用于全基因组物理图谱的构建和全基因组序列测定。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 基因组DNA文库的构建过程 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第三节 RNA操作技术 1. 总RNA的提取 RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法（TriZol）。 异硫氰酸胍法（TriZol）原理： TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第三节 RNA操作技术 2. mRNA的纯化 mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。 利用mRNA的Poly A结构，试剂盒提供一种生物素化寡聚dT引物，与Poly A杂交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的杂交体，然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用以链抗生物素-顺磁颗粒（SA-PMPs）结合杂交体，形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs复合物，再利用磁性吸附作用以磁性条吸附复合物中的SA-PMPs颗粒，最后利用高严紧度盐溶液中分子杂交体磁性减弱，杂交体中生物素化寡聚dT引物与mRNA分离，从而纯化得到mRNA。 * 南京农业大学 生命科学学院 * PolyATtract mRNA的分离纯化过程简图 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第三节 RNA操作技术 3. cDNA的合成 cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，有反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是oligo dT。第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第三节 RNA操作技术 4. cDNA文库的构建 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 步骤：在获得高质量的 mRNA 后，反转录合成cDNA，合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是 λ 噬菌体，这是因为 λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第三节 RNA操作技术 5. 基因文库的筛选 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选方法有很多种，常用的有： 核酸杂交法 PCR筛选法 免疫筛选法 南京农业大学 生命科学学院 南京农业大学 生命科学学院 南京农业大学 生命科学学院 分 子 生 物 学 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第五章 分子生物学研究法（上） ——DNA、RNA及蛋白质操作技术 * * 南京农业大学 生命科学学院 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第五章 分子生物学研究法（上） * * 南京农业大学 生命科学学院 从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 * 南京农业大学 生命科学学院 * 第五章 分子生物学研究法（上） * * 南京农业大学 生命科学学院 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒