第四章 抗体制药2.ppt

第四节 抗体工程; 抗体工程是在完全用基因工程技术制备人源性抗体，以及利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转基因动物、植物大规模生产抗体的过程中发展起来的。 抗体工程是指利用重组DNA和蛋白质工程技术，对抗体基因进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞后，表达抗体分子，或用细胞融合、化学修饰等方法改造抗体分子的工程。 ; 20 世纪 80 年代中期，Smith 在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术。 由于该技术具有生产人抗体的潜力，因此，吸引了许多学者投入这一研究中，使得噬菌体抗体库技术得以迅速发展，并由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生产路线 。; 建抗体库的目的是筛选出各种特异性的抗体分子，噬菌体抗体库在这方面有无可比拟的优势。 噬菌体抗体库在理论上人们可以用基因工程方法研制任何一种具有高度特异性的抗体，使抗体工程的设想成为现实。 ; Winter等在1994创建了噬菌体抗体库技术，克服了人体不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体，并且将抗体基因的克隆和表达融为一体，同在一种载体上进行，将抗体基因表达在载体（噬菌体）的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛(panning)，在数日内就可筛选出阳性克隆，从而能构建出大库容（108）文库，囊括天然全套抗体基因。 ;一、噬菌体抗体库技术的基本方法 噬菌体抗体库技术是用聚合酶链反应（PCR）扩增出抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，将Fab段或单链抗体（ScFv）表达在噬菌体表面，经过“吸附－洗脱－扩增”过程筛选并富集特异性抗体。; 使抗体基因以分泌的方式表达，则可获得可溶性的抗体片段。 在建库过程中如果将VH和VL随机组合，则可建成组合抗体文库；如果抗体mRNA来源于未经免疫的正常人，则可以在不需要细胞融合的情况下建立起人天然抗体库。 ;2、构建噬菌体抗体库流程 ①从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA； ②应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段； ③构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有λ噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surface display antibody library)常用载体； ④表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。 ; 首先提取细胞的总 RNA，经过RT-PCR扩增可变区基因，运用两种不同的限制性内切酶分别对纯化的轻链 PCR 产物和表达载体进行酶切，再对切割产物进行分离纯化，按一定比例将载体和轻链连接，转化感受态细胞并扩大培养，提取质粒即为轻链库。 ; 再对重链 PCR 产物和轻链库进行双酶切，纯化后按一定比例连接、转化感受态细胞，加入辅助噬菌体培养，离心取上清，加入聚乙二醇(PEG)沉淀并收集噬菌体颗粒，这样就得到噬菌体总抗体库。 ;（1）获取目的基因 一般是提取细胞的总 RNA，经过反转录（ RT-PCR）获取抗体某一特定基因片段，如重链和轻链可变区（VH、VL）基因。 抗体基因的组合形式多为单链抗体scFv，也用连接链组合成功能分子。;（2）抗体库技术的载体 噬菌体抗体库的表达载体可分为λ噬菌体、单链丝状噬菌体及噬菌粒三种系统。 噬菌粒具有噬菌体和质粒的特点，噬菌粒是应用最多的表达载体，也是简便高效模拟B 细胞产生抗体的原核表达系统。; 抗体蛋白和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式表达在载体的表面，再感染后，能使目的克隆得以扩增。 琥珀终止子密码在适当位置上引入载体是抗体库的关键性技术，而克隆位点后的基因序列则有利于对可溶性表达产物的鉴定和纯化。;（3）淘筛 淘筛的基本过程：抗原固相化后，对噬菌粒群吸附、洗涤和脱洗后，再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，使目的克隆大量的扩增。 ;;（4）表达与鉴定 目的克隆经鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用Western blot分析确定后，完成全过程。;二、噬菌体抗体库技术的特点 1、模拟天然全套抗体库 噬菌体抗体库中，可以达到1011库容，故能包含B细胞全