第四章 原生质体融合.ppt

第四章 动植物细胞融合一、动物细胞融合与单克隆抗体 二、植物原生质体的制备与融合;一、动物细胞融合与单克隆抗体 （一）概念 细胞融合又称体细胞杂交，是指两个离体细胞通过一定诱导技术使质膜接触而融合在一起，随后导致两个细胞核物质融合的技术。 ;细胞融合图; （二）细胞融合的常用方法;用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 ;聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程;（三）单克隆抗体;;;人体内的五种抗体;;动物脾脏有上百万个B淋巴 细胞，一个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克隆抗体。一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。;;单克隆抗体: 只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。;2、单克隆抗体技术（杂交瘤技术）的基本原理;3、单克隆抗体(杂交瘤细胞)的制备;淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。 免疫方法：体内法或体外法。 体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。3－4天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在95％以上的可以用于融合。 体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107个/ml，加适当浓度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴细胞。;（3）脾细胞的制备;;（5）细胞融合;;（6）融合后细胞培养;（7）抗体检测;1）诱生腹水 将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。 方法是将降植烷或石蜡油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接种3~5×106 杂交瘤细胞。10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中约含1~10mg单抗。 2）利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统等进行大规模培养。 3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗;4、单克隆抗体的应用;(一）植物原生质体：采用人工方法脱去细胞壁的植物细胞，???胞膜完全裸露。 ; 意义 理论上说，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 ;本质 A.融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制,为远缘物种间的遗传物质交换提供有效途径; B.体细胞杂交产生的杂种,细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的分裂和增殖过程中，双亲的叶绿体、线粒体、DNA、亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。;1978年德国科学家梅歇尔斯等人把马铃薯(potato)和番茄(tomato)的原生质体融合获得了体细胞杂种“泡马豆”（pomato);酶解制备原生质体;材料的来源;方法： 1.撕去叶片的下表皮，然后以无表皮的一面向下，使叶片漂浮在酶溶液中； 2.把叶片或组织切成小块，投入到酶溶液中，可与真空渗入相结合。 ;2.植物原生质体的纯化 酶解后的混合物包括：解离酶液中，有原生质体，有破碎细胞的细胞器等，也有未解离的组织或细胞。而培养只要干净的原生质体，所以要进行纯化。 纯化的方法： A、清除较大碎屑：酶解后的混合物穿过一个镍丝网（50-70um） B、清除较小的物质：1.沉降法 2.漂浮法 3.界面法 ;;13%甘露醇溶液;Purified protoplasts;3.原生质体活力测定目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。?如形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。;FDA法：醋酸酯荧光素 伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。;Regeneration of fertile shoots from A. thaliana cotyledon protoplasts. Cotyledons prepared for digestion in a 3 cm diameter petri dish (a). Protoplast divisions after 4 days of culture (b) with subsequent microcolony formation (arrowheads) after 3 additional days (c) within the identical area of an alginate gel. Protoplast-derived colonies after two weeks of culture (d). Shoot forma