第四章_代谢工程的基本思想.ppt

细胞膜组分缺失 生物素缺陷型 油酸缺陷型 甘油缺陷型 温度敏感突变株 添加表面活性剂 添加青霉素 二、生物合成途径的遗传控制 细胞膜组分缺失 生物素缺陷型 使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成 作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中 二、生物合成途径的遗传控制 细胞膜组分缺失 油酸缺陷型 使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酸培养基中油酸的浓度而控制磷脂的合成 作用机制：由于油酸缺陷突变株阻断了油酸的后期合成，丧失了自身合成油酸的能力；即丧失脂肪酸生物合成能力，必须由外界供给油酸，才能生长。故油酸含量的多少，直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性；通过控制油酸亚适量，使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右时，细胞变形，谷氨酸分泌于细胞外 二、生物合成途径的遗传控制 细胞膜组分缺失 甘油缺陷型 使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中甘油的浓度而控制磷脂的合成 作用机制：甘油缺陷突变株的遗传阻碍是丧失α-磷酸甘油脱氢酶，所以自身不能合成α-磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。在甘油限量供应下，由于控制了细胞膜中与渗透性有直接关系的磷脂含量，从而使谷氨酸得以积累 二、生物合成途径的遗传控制 细胞膜组分缺失 温度敏感突变株 与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜的结构基因上发生碱基的转换或颠换，突变基因所指导翻译的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的改变。发酵过程中，在温度转换之后，进行适度地剩余生长，完成从谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变，仅通过采用控制温度就能实现谷氨酸高产 二、生物合成途径的遗传控制 细胞膜组分缺失 添加表面活性剂 表面活性剂作为生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用，导致磷脂合成不足，结果形成磷脂不足的细胞膜，提高了细胞膜对谷氨酸的渗透性 添加青霉素 抑制转肽酶活性，破坏细胞壁合成 二、生物合成途径的遗传控制 基因工程 基因扩增——强化代谢合成途径 异源基因导入——引入新的代谢反应 基因突变——改变酶学性质 基因敲除——阻断代谢通路 代谢网络重构与优化 二、生物合成途径的遗传控制 三、生物发酵条件的控制 当菌株选育（内因）确定后，环境条件（外因）合适与否是发酵成败的重要因素。环境条件既影响微生物生长，又影响代谢速度和方向及产物形成与积累 内因 外因 环境因素对谷氨酸发酵影响 三、生物发酵条件的控制 发酵控制要解决的两个问题 发酵代谢途径问题---副产物少 发酵代谢速度问题---产物生成速率快 调控发酵条件包括 发酵温度、发酵醪基质浓度、含氧量、酸碱度、发酵时间 控制方法有: 通风、供热（冷）、调节培养基、流加补料 三、生物发酵条件的控制 四、柠檬酸发酵 黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸 生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP : HMP = 2 : 1，后者EMP : HMP = 4 : 1 黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱 由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主 生物合成途径 四、柠檬酸发酵 发酵产率 无CO2固定反应的产率 理论产率为： 192/(180×1.5)=71.1% 有CO2固定反应的产率 理论产率为： 192/180=106.7% 正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，细胞内铵离子浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感 锰缺乏时，细胞内铵离子浓度高，氨基酸浓度高（蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过升高铵离子而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的 代谢调节 糖酵解及丙酮酸代谢的调节 四、柠檬酸发酵 糖酵解的代谢调节 四、柠檬酸发酵 TCA环的起始酶--柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点 顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活。顺乌头酸