第四章药物的定量分析与方法验证-du第六版.ppt

去除蛋白质方法：1.加入与水相混溶的有机溶剂 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙睛、甲醇等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1:（1-3)时，就可以将90%以上的蛋白质除去，采用超速离心机（10000r/min )离心便可将析出的蛋白质完全沉淀。 2.加入中性盐 使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺等。盐析的方法与有机溶剂提取法常并用，药物的回收率高。 3.加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有：10%三氯醋酸等。含药物血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质，取上清液作为样品。在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。 4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有：CuS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上清液。 5.酶解法在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素，使蛋白质的肽键降解。 （二）缀合物的水解尿中药物多数呈缀合状态。含羟基、羧基、氨基和巯基的药物。可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物。含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取，常用酸水解或酶水解的方法。 （三）分离、纯化与浓集1.液-液提取法多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质。 对有机溶剂的要求:对被测组分的溶解度大,沸点低，易于浓集、挥散；与水不相混溶以及无毒、化学稳定、不易乳化等。最常用的溶剂:乙醚和氯仿等。用量：一般有机相与水相（体液样品）体积比为1：1或2:1。 生物样品一般多在碱性下提取，多数药物是亲脂性的碱性物质，生物样品中的内源性物质多是酸性的。当碱性药物在碱性pH不稳定时，则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取。 2.液-固提取法（liquid-solid extraction，LSE）将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱，以溶剂淋洗后，将生物样品通过，使其药物或杂质保留在担体上，用适当溶剂洗去杂质，再用适当溶剂将药物洗脱下来。 LSE具有优点：LSE较少引入杂质；消除了LLE的主要缺陷—乳化现象；提取效率高，可用少量生物样品进行分析；柱为可弃型，废弃物易从实验室移走；在最后洗脱中多数采用以水为主的溶剂系统，大大增加了安全性；最大的优点为处理样品速度快，并在室温下操作，尤其适于处理挥发性及对热不稳定的药物。 常用于填充柱的担体大致分为两类：1.亲水性的硅藻土，有机溶剂冲洗药物2.疏水活性炭、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶，吸附亲酯性药物，然后用有机溶剂分离药物。 3.被测组分的浓集的方法：末次提取时加入的提取液尽量少，然后直接测定。氮气流吹干减压法挥去溶剂 三、生物样品定量分析方法验证（一）特异性证明所测定的物质是原形药物或特定的活性代谢物。（二）标准曲线与线性范围回归方程相关系数r≥0.9900。在线性范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。 （三）精密度与准确度药典附录《药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则》规定考察3个浓度的精密度和准确度。 一般RSD应小于15%，在LOQ附近RSD应小于20%。 批内精密度：是同一次测定的精密度。所得RSD应争取达到5％以内，但不能超10％。 批间精密度：是不同次测定的精密度。所得RSD应控制在15％以内。 回收率：一般应在85%－115%范围内，在LOD附近应在80%一120％范围内。 （四）最低定量限最低定量限LOQ至少能满足测定3-5个半衰期时样品中的药物浓度或Cmax的1/10-1/20时的药物浓度。（五）样品稳定性在室温、冰冻和冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。 （六）提取回收率（绝对回收率）考察高、中、低3个浓度的提取回收率，它是预处理（提取）过程的回收率，反映出样品预处理过程中组分丢失的情况，是评价萃取方案优劣的指标之一，一般低于100%，但是重现性要好。 （七）质控样品质控样品系将已知量的待测药物加入到生物介质中配制的样品，用于质