考马斯亮蓝法——完整版.ppt

* Tianjin Medical University 天津医科大学药学院《体内药物分析》第三章—— 考马斯亮蓝法（Bradford法） 徐 亮 xuliang@tijmu.edu.cn 一、基本原理 酸性溶液两者结合，使染料溶液的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。 二、试剂与器材  试剂： （1）考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 （2）标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。 2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 三、操作方法 1、标准曲线的制作 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5 摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色 A595nm 以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。 2、样品中蛋白质含量的测定 另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。 四、Bradford法的优缺点 1、优点 （1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为1ug蛋白质。 （2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。 （3）干扰物质少。 *