蛋白质相互作用多种方法PPT.ppt

蛋白质相互作用研究方法 ;Protein interaction：two or more proteins (same or different) interact or form complex; 人类蛋白质组相用;蛋白质相互作用： 本身具有生物学意义：这样的相互作用在生物体中是起什么作用 发展技术：利用这样的相互作用创造出一些人为的作用 ;运用生物信息学的方法由繁入简;研究蛋白质相互作用的目的是发现并明确其相互作用的生物学意义 蛋白质相互作用是一种表象，通过表象分析规律，是研究蛋白质相互作用的核心 “种瓜得瓜，种豆得豆”是一种表象，反映了遗传这样一种本质 现象 可研究对象 合适的研究方法 ;研究蛋白质相互作用需要微观和宏观的结合; 研究蛋白质相互作用的意义 1、蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。 2、基因只是决定蛋白质，而蛋白质才是发挥作用的主体。蛋白质的相互作用是发挥其功能的主要活动。;;研究蛋白质相互作用是为了研究相应的生物学功能;从蛋白质相互作用到生物学功能。运用蛋白质直接相互作用，发现相互作用蛋白质，再分析这些作用的生物学意义。 容易犯的错误：研究一大堆的蛋白相互作用，却不知道这些相互作用有什么生物学意义。 从生物学功能到蛋白质相互作用。通过改变生物学现象，分析蛋白质间的遗传相互作用，进一步研究相关蛋白质的相互作用。 容易犯的错误：找到了平行变化的不相关蛋白质。;; 免疫共沉淀 （co-immunoprecipitation，CO-IP） 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也可能沉淀下来。蛋白质Y的沉淀是基于与蛋白质X的物理性相互作用，称为免疫共沉淀。 ;Western blot：变性抗原，主要用于检测蛋白质的存在与否。 免疫共沉淀：非变性抗原，用于鉴定不同蛋白质间的相互作用。多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100) ;免疫共沉淀检测蛋白质的原理和常见问题;实验过程;实验过程;实 验关键;主要用于： 两种感兴趣蛋白质是否在体内存在相互作用； 也用于鉴定一个特定蛋白质的未知相互作用蛋白。 注意： 1 要求在一系列清洗过程中保持蛋白质复合体不变。因为出现假阳性的概率比较高。 2 设置的对照：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 ;Western blot; 优点： 1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态； 2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响； 3、可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 ;缺点： 1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用； 2、两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； 3、如用western blot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性，灵敏度不如亲和色谱高。 ; GST pull-down技术 1988年Smith等利用GST融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白,从此GST融合蛋白在研究蛋白质相互作用领域得到极大推广(His也常用)。 此方法是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。还应当在体内用单独的方法，如免疫共沉淀加以证实。 ; 靶蛋白X基因亚克隆到带有GST基因的原核表达载体中，并在细菌中表达GST融合蛋白（GST-X）把GST融合蛋白(探针、诱饵蛋白)挂到带有GST底物的Sepharose beads上，然后把另一种含目的蛋白质（捕获蛋白）的溶液加入其中。由于谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白，如发生相互作用则形成复合物：GST-X-Y，沉淀收集下来，洗脱非特异结合的蛋白后采用SDS鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质。;GST-Pull down Assay;GST pull down;GST pull down;检测GST融合蛋白与靶蛋白相互作用： 1、放射性标记融合蛋白：快速简单易行 2、抗GST抗体检测 3、生物素标记融合蛋白：没有放射性，但可能对探针蛋白和其他蛋白的相互作用有影响。 ;应用： 一确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用； 一是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。;特点： 比较简便，如果用抗GST抗体检测或生物素标记融合蛋白避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相