血液病标准化方案PPT.ppt

流式细胞术的应用 —— 血液病的诊断;血液病基础知识 流式诊断血液病标准化方案 ;血液病基础知识;髓系 多能祖细胞;红系祖细胞;巨核系祖细胞;淋巴祖细胞;正常血细胞发育过程的抗原表达规律;Ⅰ期：原始单核细胞阶段 Ⅱ期：幼稚单核细胞阶段 Ⅲ期：成熟单核细胞阶段;Ⅰ期：原始B淋巴细胞阶段 Ⅱ期和Ⅲ期：幼稚B淋巴细胞阶段 Ⅳ期：成熟B淋巴细胞阶段;4 Ⅰ期：原始T淋巴细胞阶段 Ⅱ期和Ⅲ期：幼稚T淋巴细胞阶段 Ⅳ期：成熟T淋巴细胞阶段;Ⅰ期：原始红细胞阶段 Ⅱ期：幼稚红细胞阶段 III期：成熟红细胞阶段; 白 血 病 分 类 综合分类（FAB, 免疫性分型，染色体分型，分子生物学分型） 急性白血病 急性髓细胞白血病（AML)－ M0, M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7 急性淋巴细胞白血病(ALL)－T-ALL, B-ALL 慢性增生性白血病 慢性粒细胞白血病（CML) 慢性淋巴细胞增生性白血病 慢性淋巴细胞白血病（CLL) 淋巴瘤 其它慢性淋巴细胞增生性白血病－HCL, FL, MCL等 骨髓异常增生综合症（MDS) 浆细胞性白血病 多发性骨髓瘤（MM) 浆细胞白血病（PCL);急性髓系白血病WHO分类 伴遗传学异常的AML 伴多系增生异常的AML 治疗相关性的AML 不能按照上述分类的AML (M0-M7);急性白血病一线抗体;急性白血病补充抗体;慢性淋巴增生性疾病（CLD)抗体组合;;血液病基础知识 流式诊断血液病标准化方案 ;标准化方案;急性白血病(AL)免疫分型 ;骨髓增生异常综合征（MDS） ;B淋巴瘤（B-LPD) ;T-NK淋巴瘤 ;浆细胞瘤（MM) ;T-B淋巴细胞白血病 ;B淋巴瘤残留病(B-MRD) ;霍奇金淋巴瘤 ;标准化方案;标本的准备 （一）外周血、采集物或骨髓 1.保存方法:抗凝管室温保存，12小时内处理标本，大于24小时，肝素抗凝4℃冰箱保存 2.处理方法：无需特殊处理 3.抗凝剂的选择：血液标本可用EDTA或肝素；骨髓标本用肝素！ ;（二）体 液 1.保存方法：肝素抗凝管室温保存12小时内完成检测；储存在4℃冰箱时间应48小时。 2.处理方法：新鲜标本1000rpm离心5min,弃上清后，加入PBS离心洗涤5min，加入适量PBS，必要时300尼龙网过滤后备用;（三）组织细胞 1.保存方法：新鲜组织标本置于生理盐水或PBS中12小时内处理完标本。若4℃冰箱保存应小于48小时。 2.处理方法：机械法处理组织标本！;荧光染色： （1）细胞表面抗原标记： 1）根据实验方案（4色方案）加入4种荧光素（FITC、PE、PC7、PC5或APC)标记的相应抗体。 2）标记：加入待检标本适量与检测管；低速涡旋混匀室温避光15min。 3）溶血：加入Oplise C 溶血素0.5ml,震荡混匀，室温避光10min。 4）洗涤：加入PBS适量（3ml左右）避光室温放置10min后1000rpm 5min ； 5)弃上清液，加适量PBS（0.2~0.5ml) 混匀后上机检测，不能及时检测者置4℃冰箱内保持；24小时内完成检测。 ;（2）细胞膜和胞内抗原同时标记 1）膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量骨髓标本，充分混匀后室温避光孵育15min； 2）加入贝克曼破膜剂1液100ul混匀后室温避光放置15min； 3）洗涤：加入PBS 1200rpm 离心洗涤5min 4)加入破膜剂2液混匀后室温避光5min 5）加入胞内抗体（如MPO cCD79a cCD3等）充分混匀室温避光15min; 6)洗涤：加适量PBS 1200rpm 5min 离心洗涤！ 7）上机检测：弃去上清；加入适量PBS（200~500ul）混匀上机检测；不能及时检测则4℃冰箱保存，24小时内完成检测。;标准化方案;开机：启动FC500仪器； 质控：选择质控程序，执行flow check； 上样：根据实验项目选择相应方案模板，输入相关信息；后MCL自动上样！ 部分标本颗粒过多（如MRD)，需先200目过滤后再上机检测！ 检测过程中需要FSC /SSC门内细胞分布；若细胞分群不够清楚，需及时调整电压！ ;标准化方案;免疫分型设门、分析和报告;FSC/SSC 设门：根据FSC反应细胞大小，SSC反应细胞结构的原理；通过FSC/SSC二维点图将细胞初步分群：淋巴、单核、粒细胞；但是各区细胞有重叠，难以达到清晰分群的目的！主要初步设门！白血病的设门更多借助SSC/CD45设门法！;;;设门步骤： 采用FSC/SSC设门R1去除碎片 b.在CD45/SSC图上显示R1内细胞，分别设定R2(淋巴细