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双向电泳的操作 2007-7-4 步骤 样品制备（Sample preparation） 固相pH 梯度胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 第一向胶条的平衡（ IPG strip equilibration） 第二向SDS 电泳（SDS） 检测染色（Detection/Staining） 蛋白点的挖取，收集 质谱分析 参考资料 /bbs 蛋白质组学导论生物学的新工具 (2005) D.C. 利布莱尔 著 蛋白质化学与蛋白质组学 (2004) 夏其昌 编著 一般性原则 尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失 减少对蛋白质的人为修饰 破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态 样品制备需要的试剂 离液剂(chaotropes): 尿素（Urea）和硫脲（thiourea） 表面活性剂（sufactants）也称去垢剂： NP-40、TritonX -100 等非离子去垢剂 CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂 还原剂（reducing agents ） 二硫苏糖醇（DTT） 二硫赤藓糖醇（DTE） 磷酸三丁酯（TBP） 选择性的加入 Tris-base 蛋白酶抑制剂（ 如EDTA 、Pefabloc protease inhibitor 、PMSF or Protease inhibitor cocktails ） 核酸酶 影响蛋白质可溶性和2DE 重复性的物质 核酸 超声或核酸酶处理 脂 多糖 超速离心除去 盐类小分子 透析可以降低盐浓度，但时间太长 采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。 常用裂解液 Urea Thiourea CHAPS DTT Pharmalyte pH 3-10 Tris-Base Pefabloc protease inhibitor 1% SDS 样品制备程序 培养细胞（culture cell）样品处理方法 （1） 培养细胞的收集； （2） 用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3 次（室温，1000g， 各2min）； （3） 将细胞分装到1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的PBS； （4） 加入裂解缓冲液（1.5x106 个细胞大约加入100μL 裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解； （5） 4℃，40,000g，离心1h； （6） 吸取上清并用Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管里保存在-78℃ 备用。 组织样品处理方法 三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation） 超速离心法 IPG 胶条的水化 加样品水化 不加样品水化 加样品水化 加样品水化 IEF 限流 50uA 200V 1hr 500V 1hr 1000V 1hr 8000V 30min gradient 8000V 5hr (40000Vh) 500V 维持 IPG strip equilibration 第二向SDS 电泳（SDS） 2-DE 胶蛋白质点的检测 1）考马斯亮兰染色法； 2) 银染法； 3）负染法； 4）荧光染色法； 5）放射性同位素标记法。 考马斯亮兰染色法 经典的考马斯亮兰染色（R-250） 局限：灵敏度低（≈1μg protein/spot） Neuhoff 胶体考染法 优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spot 热考马斯亮兰染色及二次染色法 . 银染法 银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。 由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质点，故广泛的用在2D 凝胶分析上。 * * 总的策略 BACK BACK BACK BACK 分装40ml 贮存于-20℃ 这是一个贮存液。用之前在加1%DTT 或者2.5%碘乙酰胺。 BACK