生物化学基础ppt课件--章基因课件.ppt

核酸分子杂交技术用已知碱基序列作为探针，检测待测样品中与其互补的同源核苷酸序列。杂交的双方为探针和待测核苷酸序列。杂交方法有Southern印迹杂交，Northern印迹杂交，斑点及狭缝印迹杂交等。 聚合酶链反应（PCR）技术是体外酶促反应，依据DNA复制理论，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段。PCR反应体系有耐热DNA聚合酶；DNA模板；寡聚核苷酸引物；dNTP原料；含Mg2+的缓冲液等。PCR技术包括高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环。PCR技术简单快捷，具有高度灵敏性和特异性。 3、重组DNA导入宿主细胞 转化：以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 感染：以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程 4.重组DNA的筛选与鉴定： 遗传学、免疫学、分子杂交等 5.克隆基因的表达 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。 基因工程的主要步骤 二、基因诊断和基因治疗 （一）基因诊断（DNA diagnosis） 基因诊断是采用分子生物学的技术方法直接检测与分析基因的结构（DNA）及其表达水平（RNA）是否正常，从而对疾病做出诊断的方法。 1.基因诊断特点： 特异性强 灵敏度高（选用特定基因序列作为探针，单拷贝基因采用高度扩增PCR技术） 诊断范围广（可检测正在生长的病原体或潜在病原体）。 能对疾病早期进行诊断 直接对表型疾病作出诊断，还可能发现潜在的致病因素，如: 确定有遗传病家族史的人携带致病基因。 2.基因诊断的应用 1）病原微生物的侵入：病原体：病毒、支原体、细菌、寄生虫。当无抗体时，基因诊断成为唯一手段。 2）先天性遗传疾病：遗传性疾病。发病原因为特定基因突变。 3）恶性肿瘤研究：个别细胞基因突变而引起的细胞无限增殖.（包括抑癌基因和癌基因） 3.基因诊断的基本原理与方法 基因诊断的原理：用已知的核苷酸序列测定未知的核苷酸序列。 基因诊断主要方法：核酸分子杂交、PCR技术、DNA序列测定、几种技术手段联合应用等 α-地中海型贫血症（病例） 一对夫妻第一胎生一男孩，经诊断为重型α-地中海型贫血症，即Hb Hart’s 胎儿水肿综合症。为常染色体隐性遗传病。妻子又怀孕，夫妻想知道胎儿是否正常发育，欲做产前诊断。专家运用限制性内切酶BamHI和 BglⅡ分别酶切孕妇的外周血和胎儿绒毛组织DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离后，进行Southern印迹转移后，再用32P标记的α-珠蛋白基因探针进行杂交。分析所得酶谱，检测结果该胎儿为α-地中海贫血。 （二）基因治疗（gene therapuy) 狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗，是 对缺陷的基因进行修复、矫正，或以正常功能的基因置换 或增补缺陷基因的方法。治疗途径属于体外（ex vivo） 基因治疗。 广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗，是一种基于导 入遗传物质以改变患者细胞的基因表达，从而达到治疗或预防 疾病的新措施。治病途径属于体内（in vivo）基因治疗。 基因治疗总策略 1.直接补替缺陷基因； 2.抑制非正常基因产物表达； 3.间接调节机体本身免疫系统的抗病能力； 4.利用外源基因对病变细胞造成特异性杀伤。 基因治疗方法： ①基因矫正（gene correction）：即对缺陷基因的异常序列进行精确原位修复。 ②基因置换（gene replacement） ：以正常功能基因原位置换异常基因，不涉及基因组的任何改变。 ③基因增补（gene augmentation）：不去除异常基因，而是通过外源基因的导入，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。 ④基因失活（gene inactivation）：有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵转录因子来封闭或消除这些有害基因的活性表达。 基因疗法最重要的问题：理想载体的选择 安全无毒害；不引起免疫反应；高浓度或高滴度；能高效转移外源基因；持续有效表达外源基因；可靶向特定组织细胞；可调控；容纳外源基因可大可小；可供体内注射（包括全身性静脉注射）；便于规模生产供临床应用。 基因工程技术在分子医学上的应用： ①发现疾病基因。确定克隆基因在分子遗传病中的作用。 ②发展生物制药。利用重组DNA技术生产有药用价值的蛋白质、多肽产品。己经或正投入市场的基因工程产品有胰岛素、生长素、促红细胞生成素等。 ③基因诊断。 ④基因治疗。 ⑤遗传病的防治。利用基因工程技术可进行产前诊断、携带者测试、症候前诊断、遗传病