【生物课件】生物化学与分子生物学实验原理--蛋白质的分离纯化(下)(ppt 111).ppt

生物化学与分子生物学实验原理（I）-蛋白质的分离纯化 高效液相-HPLC（High-Performance Liquid Chromatigraphy） The principle of chromatography 保留时间 从进样开始到达检测器所需要的时间. 在峰尖的位置测量 影响 tR 的因素有: 流动相的线形流速 色谱保留 色谱保留 被分析物 (样品成份) 在两相之间的平衡 Amobile Astationary 塔板理论Plate theory 将色谱假设为一个蒸馏塔,塔内有许多块塔板,样品各组分在每块塔板的液相和固相间进行分配. 理论塔板数模型(Theoretical Plate Model) 塔板数的确定 对塔板理论的讨论 柱效(Column Efficiency) 等同于理论塔板的柱高用来测量柱效( column efficiency) H = L / N 柱长单位必须在两相之间完全平衡 小的H 意味着更高的分离效率 L 是以米为单位的柱长度 N 为理论塔板数: 大的 N 较好 1. Thermal dynamic equilibrium 对分配系数的讨论 选择性(Selectivity) 理想地状况: 1 ? k ? 5 如 k 1, 洗脱太快以至于不能准确地确定 tR k 20意味着洗脱需要很长的时间. 目标: 分离度(Resolution) Resolution (Rs) 定义为: 分离度的表达式： a : Choosing a different type of molecular interaction by changing stationary phase k : changing temperature or mobile phase N : length of column H : flow rate, particle size of packing, viscosity of the phase 4.2 分子筛层析凝胶过滤 分子筛 凝胶过滤色谱的原理 凝胶过滤色谱 基于大小不同的蛋白从限定大小颗粒内径的层析柱中进行洗脱体积(或流速一定时的洗脱时间)的差别 蛋白越小,在柱中的保留时间越长, 洗脱体积越大, 洗脱时间越长 对于蛋白的聚集敏感. Gel Filtration Chromatography 进入胶颗粒中孔道的蛋白较之于被排阻在孔道之外的蛋白移动的较慢. 分离与蛋白的形状及大小有关 凝胶过滤色谱的基本术语 Vt = 总体积 (Total volume , the excluded volume plus the internal volume of the beads) 床体积: 膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积 Vo = 外体积, 孔隙体积, 外水体积 (outer volume, the excluded volume surrounding the beads) 基质颗粒之间体积的总和 可用蓝色葡聚糖2000(2000Kd)测定. the void volume all sample molecules have access to the liquid between the beads ~30% Vg=凝胶本身的体积 the backbone volume the non-porous part of the beads is inaccessible for the sample molecules. 3-5% Kav = 分配系数 (Partition Coefficient) 一组分在固定相与流动相中含量的比值. －－分离化合物在内水和外水体积中的比例关系。 表示排阻的程度 Kav = （Ve- Vo）/(Vt-Vo) Ve=Vo+ Kav *(Vt-Vo) 凝胶过滤色谱 Kav ＝（Ve-Vo ） /Vi Kav =0, Ve＝Vo，全排阻。 Kav =1,Ve=Vo+Vi, 全进入。 0 Kav 1, 部分进入。 Kav 1, 吸附作用。 Molecules with partial access to the pores will be retarded in relation to their respective degree of access to the pores Molecules with full access to the pores will all move down the column at the same speed and