【生物课件】生物化学与分子生物学实验原理--蛋白质的分离纯化(上)(ppt 115).ppt

生物化学与分子生物学实验原理（I）-蛋白质的分离纯化 1. 背景介绍 1.1 蛋白质(Proteins)的概念 1.2 蛋白质的理化特性 1.3 其它 1.1 蛋白质（Proteins） 蛋白质由二十种标准氨基酸组成. 所有的氨基酸均有一共同的中心结构（α-碳原子）,并由肽单位形成蛋白质的骨架. 氨基酸的侧链可以是非极性的，极性的，或者带电荷的. 蛋白可以折叠为一特定的形状或者保持一定的扭动。 多数蛋白的密度在1.3－1.4g/cm3 细胞经常添加磷酸基团,糖基及酰基到侧链上以改变蛋白的形状及活性。 1.2 蛋白质的理化特性 每个蛋白质均有特定的等电点. 由其可解离的侧链基团所决定－－－－在一定的pH值下，每个蛋白的荷电状况不尽一致 虽然很多蛋白质（水溶性的球蛋白）其大部分的极性侧链基团（亲水基团）折叠在外部，但是其表面仍有部分的疏水性区域。 1.3 其它 体内蛋白质的制造受控于遗传信息 DNA: TAC CGA TCG TGA ACT 基因突变对于蛋白的效应 DNA: TAC CGA TCG TGA ACT 基因组, 转录组及蛋白组( Genome, Transcriptome and Proteome) 2. 蛋白质分离、纯化的目的 活力的生化分析 蛋白的翻译后修饰（Post-translational modifications) 相互作用和蛋白的装配(Interactions and assembly) 三维结构(3-dimensional structure) 生物功能分析(Analysis of biological function) 药物开发(Drug development) ------ 3. 蛋白的纯化方法 离心(Centrifugation) 过滤(Filtration) 沉淀(Precipitation) 色谱(Chromatography) 电泳(Electrophoresis)? ?: 常用于小规模（分析目的）制备 策 略 尽可能的用较少的步骤 尽可能少的丢失活力 从哪儿开始? 细胞与组织(材料来源有限，但是蛋白是天然的状态)。 折叠均一, 可溶（主要指非膜蛋白）； 可通过差速离心分离细胞组份； 纯化可用色谱方法（chromatography）。 cDNA克隆（为目前蛋白来源的主要方法，但是蛋白易形成包涵体（inclusion body）） 重组蛋白基因在大肠杆菌， 昆虫细胞， 哺乳动物细胞或植物细胞中表达。 也用差速离心及色谱方法纯化。 在重组的蛋白中可以添加‘Tags’以便于纯化。 3.1 蛋白质粗分离:(I)从细胞和组织----提 取 有关组织提取的影响因素 Buffer（缓冲液）pH值 inoic strength（离子强度） metal ion chelators（金属离子螯合剂） reducing agents（还原剂） protease inhibitors（蛋白酶抑制剂） Temperature（温度） tissue disruption（组织的破碎方式） pH值 缓冲液的pH对于成功提纯蛋白尤为重要 缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变 避免极端的pH 造成蛋白化学成分的改变 高pH 一些氨基酸残基（Gln and Asn）的脱氨作用 丝氨酸及苏氨酸（Ser and Thr）残基的β－消去反应 肽健的部分水解 低pH 引起蛋白的沉淀及变性。 修饰的磷酸基团丢失. 缓冲液 选择一种缓冲液使其可以有效的覆盖想要pH范围。 一些缓冲液（如Tris-HCl）的pH可以发生改变。对此，必须小心，以免发生错误或变性你的蛋白。 应当在buffer所使用的温度下调节溶液的pH值 eg. Tris buffer 25℃ pKa 8.06 0℃ pKa 8.85 离子强度（Ionic strength） 蛋白的溶解性依赖于离子强度 高离子强度可造成蛋白的聚集或沉淀 低离子强度能影响酶的稳定性 一些蛋白对一定的离子(Na+, K+, Cl-, SO42-)有选择性（偏好性） 0.1-0.2mol/L NaCl or KCl模拟生理状况下的离子强度. 金属离子螯合剂(Metal ion chelators) 一些组织含有Mg2+, Ca2+及 Mn2+ ions 一些螯合剂常被用于除去阳离子(2-10mM)。 e.g. (EDTA（0.1-5mmol/L ）--大多数金属离子 EGTA---Ca2+， o-phenanthroline, 邻二氮杂菲---Zn2+ 螯合剂可使提取物粘度降低,使