幽门螺杆菌分离培养和鉴定.doc

幽门螺杆菌分离培养和鉴定 1．实验设备： CO2气瓶、N2气瓶、CO2气袋、N2气袋、厌氧培养瓶、负压泵、通气管道（带阀门）、培养箱、生物安全柜、酒精灯、接种环、普通天平、电子天平、高压锅、玻片、显微镜、香柏油、平皿、三角瓶（带盖）、10ml吸管、1ml吸管、吸头、200μl冻存管、细胞冻存管、普通冰箱、低温冰箱（-80℃）、液氮罐、无菌滤器、加样器、无菌注射器 2．实验材料： 牛脑心浸液或布氏肉汤、月示 蛋白胨、胰胨、氯化钠、磷酸氢二钠·12H2O2/无水、琼脂粉、抗生素（万古霉素、多粘菌素、二性霉素）、羊血、葡萄糖（10%）、小牛血清、氢氧化钠（2M）、蒸馏水、甘油、淀粉、pH试纸、革兰染液、快速尿素酶试纸、过氧化氢（3%）、氧化酶试剂、β-环糊精、酵母提取物、重亚硫酸钠 3．有关试剂的配制： （1）选择剂：万古霉素（）、多粘菌素（）、二性霉素（），称量溶解后，采用抽滤除菌，按照每次配制200 ml培养基所需量（）分装，-20℃保存备用半年。 （2）Hp培养基（）月示 蛋白胨氯化钠、磷酸氢二钠Hp牛脑浸液培养基月示 蛋白胨、胰胨、氯化钠、磷酸氢二钠·12H2O2无水、β-环糊精琼脂粉将胃粘膜组织置于小牛血清布氏肉汤运送培养基中送检”以上者才取材，两个以+者不用取材，分离阳性率低。 （4）标本送到实验室后在接种前。最好放得干一点，太湿的话不容易成功。 （5）标本用分区划线的方法划开。 第三军医大学 固体平板： 1）临床标本分离程序：在胃镜室将胃粘膜放在平皿上，用无菌镊压一下，防止掉落。不能够在胃镜室时间太长，否则会死亡。拿到实验室后，用无菌的眼科镊（弯头）在平皿表面反复涂划一区（一区划的面积不要太大，尤其是动物的胃标本，其中的杂菌太多），然后用接种环用分区划线的方法将其在培养基表面分开。 2）纯培养程序：将分离培养的可疑菌落或储存的菌种直接用连续划线或分区划线接种即可。注意：如果是挑选的可疑菌落，最好一个菌落划一小区，一块平板可以多划几个小区，将来经过鉴定可以选出真正的Hp来。 3）液体培养：准备20ml的肉汤培养基，用无菌的吸管吸取2ml加入到固体平板纯培养物中，用L棒反复推洗，将细菌洗下，吸取全部菌液，加入到液体培养基中，注意：锥形瓶的盖子不能够拧得太紧，有助于气体进入。设置微需氧条件。摇床培养24小时，振荡培养箱的振荡速度80-130r/min，终止培养，观察液体的透亮度，吸取菌液，革兰染色后观察形态，形态不典型者，转种Hp固体平板培养基，再次分离培养（-20℃保存可等一周），吸取液体培养产物50μl，加入固体培养基中，用接种环划线散开。 注意：液体培养只能用于增菌，对于标本中混合有杂菌的标本，不能使用。 5．Hp的培养： （1）微需氧条件（5%氧气、85%氮气、10%二氧化碳）建立：采用抽气换气法。将培养基放入厌氧培养罐，拧紧螺丝，首先用负压泵抽气至表-0.06的位置，（不能够完全抽空，目的是留5%的氧气），关上抽气阀，打开氮气控制阀至-0.01，随后关上氮气阀，打开二氧化碳气阀，充气至0，随后关上厌氧罐的阀门。 （2）湿度控制：在厌氧罐中放入一装水的青霉素瓶，打开瓶塞，保证湿度。 （3）培养温度：35-37℃，3-5天观察结果。①培养瓶必须保证不漏气，进行全方位检测合格后方可充气培养；每次观察结束后需要继续培养者必须重新充气；②由于胃液存在多种过路菌，一般原代培养不使用液体培养基；③为提高阳性率并防止污染，原代培养可应用非选择性和选择性培养平板各1块；④条件好的实验室在接种3天后每天观察一次，条件差时，打开培养罐次数过多可能增加污染机会。 6.培养物： Hp的菌落为无色半透明，针尖大小，似露滴状。菌落数可能较少（甚至每块板只有1个），需仔细对光观察以免遗漏；L棒接种菌量大时，菌落在培养板表面融合成一层半透明的菌苔。液体培养24小时结束，固体平板版的纯培养2-3天结束，临床标本分离3-5天结束。临床分离物中，由于存在较多杂菌，因此需要耐心的寻找“可疑菌落即无色半透明，针尖大小，似露滴状”，随后转种血平板，转种时可以多分区域，每个区域种几个可疑菌落，最后鉴定。 7.临床分离株鉴定： （1）首次从平板中分离出的可疑菌落往往很小很少，直接鉴定存在一定的困难，因此除非在有很多菌落的情况下，否则必须作纯培养后继续鉴定。 （2）革兰染色：从临床标本分离的Hp形态往往很典型，呈细长，弯曲，S型或海鸥展翅状，革兰染色阴性。此有重要鉴别价值！据此基本可以确诊。因为胃内很少有杂菌，更何况形态如此典型的杂菌。 （3）快速尿素酶试验：购置快速脲酶试纸（福建产品），将可以菌落涂抹上去，很快显色者即为尿素酶试验阳性。 （4）触酶试验：在玻片上滴加1滴3%过氧化氢，刮取可疑菌落置入后，阳性者可见到连续的氧气泡形成。 （5）氧化酶试验：取