抑制性消减杂交：生成差异调控或组织特异性cDNA探针和文库的方法.docx

Proc. Natl. Acad. Sci. USAVol. 93, pp. 6025–6030, June 1996Biochemistry抑制性消减杂交：生成差异调控或组织特异性cDNA探针和文库的方法LUDA DIATCHENKO*, YUN-FAI CHRIS LAU?, AARON P. CAMPBELL?, ALEX CHENCHIK*, FAUZIA MOQADAM*, BETTY HUANG*, SERGEY LUKYANOV?, KONSTANTIN LUKYANOV?, NADYA GURSKAYA?, EUGENE D. SVERDLOV?, AND PAUL D. SIEBERT*摘要 一种高效消减cDNA文库构建的新方法，抑制性消减杂交（SSH），已被开发。它是基于最近报道的抑制性PCR，并整合了常规和消减步骤。常规PCR步骤使所有目标cDNA的丰度都达到同一水平，消减步骤则排除了检测子与驱赶子共有的序列。在一个标准系统中，SSH技术能够在一轮消减杂交中富集稀有cDNA达1000倍以上。我们通过构建一个睾丸特异性cDNA文库和用消减cDNA混合物作为杂交探针鉴定人类Y染色体粘粒文库中的同源序列证实了这一技术的有效性。人类DNA在分离粘粒的插入，进一步确证了它在睾丸中特异性表达的方式。这一结果表明SSH技术可应用于许多分子遗传和定位克隆研究，来鉴定疾病，发育和组织特异性或差异表达的基因。正文 在高等真核细胞中，例如细胞生长，器官形成等生物学过程都受控于基因表达的不同。要弄清调控这些过程的分子机制，必须鉴定，克隆和深入研究相关的差异表达基因（1－3）。消减cDNA杂交是鉴定和分离差异表达基因cDNA强有力的方法。至今，已有大量的cDNA消减方法见于报端。概括而言，它们都涉及用一种（检测子）cDNA与另一种（驱赶子）过剩的mRNA（cDNA）杂交，然后从杂交的共有序列中分离出不杂交的片断（目标片断）的方法。其中后一步骤通常能够用羟磷石灰层析（3）亲和生物素结合（1，4，5）或Oligo(dT)30乳胶粒（2）等方法解决。尽管运用这些方法已成功地鉴定了许多像T细胞受体（3）这样的重要基因，但想获得一些转录丰度较低的基因，这些方法就往往是效率极低的。这些消减技术通常需要多于20μg的Poly(A)＋RNA，包括多步或反复的消减步骤，是高工作量的。最近报道，一种叫做代表性差异分析（RDA），基于PCR的新技术，不需要单链（SS）和双链（ds）cDNA的物理分离。代表性差异分析已被用于富集那些在大小或代表性上有差别的DNA片断（6）和克隆差异表达的cDNA（7）。然而，代表性差异分析不能解决个别mRNA丰度差异较大的问题，结果仍需多轮消减（7）。用随机引物PCR做mRNA差异显示（8）和RNA指纹图谱可能是更快的鉴定差异表达基因方法。但是，这两种方法都存在假阳性率太高的问题（10，11），对于高拷贝数的mRNA存在着偏差（12），在预期仅有少数基因不同的实验中可能是不合适的（11）。本文中，我们提供了一种基于PCR的cDNA消减新方法，抑制性消减杂交（SSH），并证实了它的高效性。SSH用于选择性扩增目标cDNA片断（差异表达的）同时抑制非目标DNA的扩增。这一方法基于我们实验室曾报道的抑制性PCR：当长距离反向重复末端附上DNA片断时，能够选择性抑制非目标片断在PCR过程中的扩增（14，15）。最近我们就在染色体步行［chromosome walking］（14）和cDNA末端扩增（15）中运用了抑制性PCR。这里介绍的消减方法以标准的杂交动力学克服了mRNA丰度差异的问题，取消了单链cDNA和双链cDNA物理分离的中间步骤，仅需一轮消减杂交就能富集多于1000倍的差异表达cDNA。我们通过构建睾丸特异性cDNA文库和鉴定选择的cDNA克隆充分证实了SSH方法的高效率。而且，表明消减cDNA混合物可被直接用做杂交探针来筛选重级DNA文库，如人Y染色体粘粒文库，从而鉴定染色体或组织特异表达序列。材料和方法：寡聚核苷酸（凝胶纯化）CDNA合成引物：Pr16，5? TTTTGTACAAGCTT30-3?接头：接头1，5? －GTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3? 3?- CCCGTCCA-5? 接头2，5? －TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3? 3?-GCCTCCCGCCA-5?3.PCR引物：P1，5?-GTAATACGACTCACTATAGGGC- 3?P2，5?-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA- 3?PN1，5?-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT- 3?PN2，5?-AGGGC