激光扫描共聚焦显微--杲海霞.ppt

激光扫描共聚焦显微镜 Laser Scanning Confocal Microscope (LSCM) 采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上，使用紫外或可见光激发荧光探针，采用共轭聚焦原理和装置，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套集观察、分析和输出为一体系统。它把光学成像的分辨率提高了30%~40%，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。 LSCM 的发展 1957年 提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获 得了美国的专利。 1967年 成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横面。 1970年 牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型 的扫描共聚焦显微镜。 1984年 Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品。 1987年 White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦 显微镜时代的到来”一文，标志着LSCM已成为进行 科学研究的重要工具。 随后Zeiss、Leica、Meridian等多家公司相继开发出不同型号的共聚焦显微镜。随着技术的不断发展和完善，产品的性能也不断改进和更新，应用的范围也越来越广泛。 ???? LSCM与普通荧光显微镜的图像质量比较 LSCM的重要组件 主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。 激光器 显微镜：物镜 载物台 计算机系统：图像分析与控制系统 激光扫描共聚焦显微镜 vs 荧光显微镜 激光作为光源的优点 单色性强 谱线宽度可小于10-8 nm 方向性强 发射角仅为毫弧度数量级 高亮度 相干性好 基于上述主要特点，激光作为扫描共聚焦显微镜的光源是最理想的 物镜 数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。是物镜的主要技术参数，是判断物镜性能高低的重要标志。 N.A=n*sin a/2 n：物体与物镜间媒质的折射率 a\2：物镜孔径角的一半 溴萘折射率1.66，香柏油1.515，玻璃1.52，水的为1.3，空气为1。香柏油与玻璃折射率相似，故光折射少，透光率高，成像清楚。 N.A. 越大：放大倍数越大，分辨率越高， N.A. 越大：视场宽度与工作距离越小 ???? 激光共聚焦显微镜原理 图2. 探测针孔的作用示意图（解释了出射小孔所起到的作用） 只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。 LSCM扫描图像方式 单一光学切片扫描 (single optical section, x-y) 时程活细胞扫描 (time lapse live cell imaging, x-y-t) 三维扫描及重构 (3-D reconstruction, x-y-z) 四维扫描 (4-D imaging, x-y-z-t) 单一光学切片扫描 (single optical section, x-y) 时程活细胞扫描 (time lapse live cell imaging, x-y-t) 三维扫描及重构 (3-D reconstruction, x-y-z) 一种高分辨率的显微成像技术 1 用激光做光源，激光单色性好，光源波长相同，从根本上消除了色差。 2 采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个带有小孔的挡板，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差，并进一步消除了色差。显微图象的清晰度和细节分辨能力。 3 采用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细小的激光束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合成一个整体。传统的光镜在场光源下一次成像，标本上每一点都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。 4 用计算机采集和处理光信号，并利用光电倍增管放大信号，它代替了人眼和照相机进行观察，摄像，得到的图像是数字化的，可以在电脑中进行处理，进一步提高图像的清晰度。 5