klf2调控s1pr1对类中性粒细胞迁移影响word论文.docxVIP

DEPCdiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯mRNAmessage ribonucleic acid信使核糖核酸PAGEpolyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳rpmrevolution per min每分钟转速TrisTris (hydroxymethyl) aminomethane三(羟甲基)氨基甲烷Ficollasucrosepolymerofhighmolecularweight聚蔗糖2中文摘要KLF2调控S1PR1对类中性粒细胞迁移的影响研究生石丹丹导师朱黎明教授主任医师目的和意义：支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，约50%的哮喘与嗜酸性粒细胞炎症有关，而其余的哮喘中大部分伴随着中性粒细胞增多。在重症哮喘患者的诱导痰中，中性粒细胞比例明显增加。哮喘中性粒细胞增多与中性粒细胞凋亡延迟或减少有关，也与中性粒细胞表面粘附迁移分子表达增加，引起迁移增加有关。本文从细胞水平研究KLF2 是否调控S1PR1，影响类中性粒细胞迁移。方法：（1）将HL-60 细胞用含1.3%DMSO 培养5 天后，分化为类中性粒细胞，通过迪夫快速染色法观察细胞核形态及RealtimePCR检测中性粒细胞分化标志物CD11b mRNA的表达，确定是否诱导成功。（2）用空载及KLF2-RNAi 慢病毒载体感染类中性粒细胞。应用荧光显微镜鉴定感染率。应用Western blot、RealtimePCR进行KLF2 敲减率鉴定。（3）RealtimePCR检测三组(空白组、空载组、干扰组)中KLF2、S1PR1 mRNA 的表达，Western blot检测三组中KLF2、S1PR1 蛋白的表达，免疫荧光检测KLF2 蛋白表达。（4）应用Transwell实验计数0.1μMS1P对三组类中性粒细胞的趋化迁移率。结果：1.成功的将HL-60细胞诱导成类中性粒细胞将HL-60细胞用含1.3%DMSO培养5天后提取细胞，经迪夫快速染色法发现细胞体积变小，出现肾型核。Real-timePCR检测CD11b mRNA表达情况，类中性粒细胞CD11b 表达明显增加（P＜0.01）。2.慢病毒转染①荧光显微镜下观察干扰组和空载组的感染效率，感染效率达到90%以上。②KLF2表达情况3Real-timePCR结果中，干扰组较空白组、空载组KLF2 表达明显减少（P＜0.01），空载组和空白组KLF2表达基本相同（P＞0.05），计算其敲除率约为81%。慢病毒成功干扰KLF2 基因表达，且排除病毒本身的干扰。免疫荧光显示，干扰组较空白组、空载组KLF2表达减少。S1PR1mRNA表达变化RealtimePCR结果中，干扰组较空白组、空载组S1PR1 表达明显减少（P＜0.01），S1PR1蛋白表达变化Western blot结果中，干扰组较空白组、空载组S1PR1 表达明显减少（P＜0.01）。Transwell实验：选取0.1μM 浓度的S1P进行Transwell实验，干扰组较空白组、空载组，迁移率明显减少（P＜0.01）。结论：KLF2 通过上调S1PR1 表达，促进S1P趋化下的类中性粒细胞迁移。关键词：KLF2、S1PR1、S1P、类中性粒细胞、迁移。本研究受国家自然基金（编、湖南省科技计划项目（编号2010FJ6113、2012FJ3075）、湖南省卫生厅科研基金（编号B2011-104）资助。AbstractTheroleofKLF2regulateS1PR1inneutrophil-likecells migrationObjectiveandmeaning:Bronchialasthmaisachronicairways inflammatorydisease,about50%ofasthmarelatedtoeosinophilic inflammation,whereasmostoftherestofasthmaaccompaniedbyan increaseofneutrophils.Insputumofpatientswithsevereasthma,the proportionofneutrophilsincreasedsignificantly.Theincreasing neutrophilsisrelatedwithreducinganddelayingapoptosis,butalsowith increasingmigrationthroughincreasingsurfaceadhesionmolecule.This articleistoinvestigatewhetherexistKLF2regulateS1PR1on4neutrophil-like