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LKB1-AMPK-mTOR通路在oxLp(a)诱导HUVECs自噬中的作用研究研究生：李爽导师：王佐教授专业：病理学与病理生理学摘要【研究背景】高Lp(a)被认为是As的独立危险因子，Lp(a)被证实比LDL更易被氧化，形成为其氧化产物oxLp(a)，与天然的Lp(a)相比，oxLp(a)被认为更具致动脉粥样硬化(As)作用潜质。临床研究表明，oxLp(a)更易在动脉内膜处积累，并与动脉内膜增厚病症成显著相关性。自噬被认为是As病理过程中发挥重要作用的细胞应激反应。有研究显示oxLDL 可以引起HUVECs 的自噬发生，从而降解细胞摄取的氧化脂质，但具体机制尚不清楚。本课题组前期工作证实oxLp(a)可引起HUVECs内的活性氧的生成量的增加，而活性氧可以引起细胞发生氧化应激进而激活自噬通路LKB1-AMPK-mTOR 诱导细胞发生自噬已是公认的事实。因此，本研究推测oxLp(a)可以通过被细胞摄取到细胞内，使细胞内活性氧的生成量增加，通过活性氧激活AMPK-mTOR信号通路诱导细胞发生自噬，以降解被摄取的oxLp(a)以及分解在oxLp(a)所产生的氧化环境下细胞内被氧化的蛋白，进而发挥自噬对HUVECs产生保护作用。2【方法】首先分析oxLp(a)诱发HUVECs自噬的发生。用不同的浓度梯度氧化Lp(a)作用HUVECs 不同时间，蛋白印迹法检测自噬标志蛋白LC3 和beclin1的表达情况，RT-PCR 检测自噬基因beclin1的mRNA的表达水平。自噬抑制剂3MA和CQ与oxLp(a)共孵育下，以及细胞形态学LC3 细胞免疫荧光和MDC 自噬泡染色方法检测自噬标志物的表达情况，系统分析oxLp(a 诱导HUVECs 自噬的发生。其次，DCFH-DA法检测oxLp(a)诱导的细胞活性氧的产生。Westernblot法检测NAC对oxLp(a)诱导的自噬蛋白LC3和beclin1的含量。第三，在细胞用不同时间的相同浓度的oxLp(a)处理下，加入PARP-1 特意抑制剂3AB，AMPK 抑制剂CompC与oxLp(a)共孵育HUVECs，Westernblot检测信号通路关键蛋白PAR，LC3 表达、AMPK、p70S6K和4EBP1 的磷酸化水平。细胞免疫荧光检测自噬蛋白MAP1-LC3 表达量，MDC 染色法检测自噬泡的数量。【结果】1、oxLp(a)浓度和时间依赖性上调自噬标志蛋白LC3和beclin1的表达，oxLp(a)浓度依次从低至高为0，25，50,100,200μg/ml，处理HUVECs 6h，提取细胞总蛋白，自噬蛋白LC3 和beclin1 表达均随oxLp(a)浓度的升高而增加，并在100μg/ml处达到峰值；而在100μg/ml 的oxLp(a)分别处理HUVECs 不同时间时，分别在0h，1.5h，3h，6h和12h时提取细胞蛋白，Western blot检测到自噬蛋白LC3和beclin1均随时间增加而上调并且在6h时呈现一个峰值；而自噬抑制剂3MA和CQ与100μg/ml 的oxLp(a)共孵育6h下，LC3细胞免疫荧光和MDC染色法可以检测出自噬水平的显著下调，提示oxLp(a)可以诱导HUVECs发生自噬。2、oxLp(a)可以增加HUVECs内活性氧的生成量，并以浓度和时间依赖式上调胞内活性氧的水平，以H2O2作为胞内ROS的的阳性对照，并且活性氧清除剂NAC与oxLp(a)共孵育细胞6h下，细胞ROS生成量明显下降。与并且NAC可以有效缓解oxLp(a)诱导的HUVECs的自噬，与oxLp(a)共处理HUVECs，自噬蛋白LC3表达量与oxLp(a)组相比明显下降，提示oxLp(a)可以增加HUVECs ROS的水平，并且ROS参与了oxLp(a)诱导的细胞自噬。3、oxLp(a)处理HUVECs，与空白组比较，Western blot检测结果显示自噬信号相关通路蛋白PARP-1、自噬蛋白LC3表达显著上调，而PARP-1的特异性抑制剂3AB的加入与3oxLp(a)共同处理HUVECs，PAR和LC3的蛋白水平含量明显下降，同时，MAP1-LC3细胞免疫荧光检测LC3含量降低，而MDC染色法检测自噬泡的数量显著减少。另外，oxLp(a) 处理HUVECs 可明显增加AMPK的磷酸化作用，同时mTOR下游两个蛋白p70S6K和4EBP1的磷酸化水平明显下降。AMPK的特意抑制剂Comp C与oxLp(a)共同处理HUVECs，AMPK的磷酸化水平以及LC的蛋白表达明显下调，而mTOR下游的两个蛋白p70S6K和4EBP1的磷酸化水平与对照组相比显著上调。证明oxLp(a)通过激活LKB1-AMPK-mTOR信号通路，诱导HUVECs自噬的发生。【结论】1、oxLp(a)可诱导H