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microRNA 对 hERG 基因表达影响的研究摘要背 景 与 目 的： 恶性室性心律失 常是导 致心 源性猝死 ( SCD)的主 要原因， 但因其 诱 发 因 素 繁 多 、 发 病 机 制 不 详 ， 难 以 得 到 有 效 的 预 防 及 治 疗 。 其 中 临 床 常 见 的 获 得性长 QT 综合征 (aLQTS)致尖端 扭转型 室 性心动过 速 (TdP)是导致 SCD 的重要 原 因之一。 大量研究 证实，阻滞 hERG（即 KCNH2） 基 因 所 编 码 的 快 速 激 活 延 迟 整流钾电 流（ IKr）通 道时，可 引起外 向钾 电流减少 ，使心 肌细 胞复极延 长，易 产 生 TdP。 近 年 来 ， 有 研 究 表 明 ， 微 小 RNA(miRNA)表 达 水 平 异 常 ， 可 引 起 离 子 通 道 蛋 白 表 达 紊 乱 ， 导 致 离 子 通 道 失 衡 ， 诱 发 心 律 失 常 。 本 研 究 组 前 期 已 通 过 双荧光素酶基因报告法 从最初预测的 6 个 miRNA （ miR-134、miR-143、miR- 103、miR-147、miR-185、miR-3619）中，初 步筛选出 4 个与 hERG 基因有 相关性（ miR-134 、 miR-143 、 miR-103 、 miR-3619 ） 。 本 实 验 旨 在 进 一 步 验 证 所 筛 选 miRNA 与 hERG 基 因的相关 性，并 以 hERG 基 因为靶 点，探 讨 miRNA 对 其功 能的影响 ，为 aLQTS 发生机制 的研究 提供 新的思路 。方法： 1.将 WT-hERG 转染 至 U2OS 细胞 中，用浓 度为 400μg/ml G418 筛选出 稳 定表达 WT-hERG 的 单 克 隆 细 胞 ； 2.用 miRNA 及 其 相 应 的 反 义 寡 核 苷 酸 序 列（AMOs）对 hERG-U2OS 细胞 模型进 行 干预； 3. RT-PCR 检测 miRNA 对 hERG 基因相关 mRNA 表 达的影响 ，western blot 检测 miRNA 对 hERG 基因相 关蛋白 质表达的 影响， 激光 共聚焦检 测 miRNA 对 hERG 基因相 关蛋 白质定位 的影响 。 结果：Western blotting 结果 显示， 用 400μg/ml G418 筛选 出 的转染 WT-hERG 的 U2OS 细胞， 可 见两条明 显的蛋 白质 条带 ，分 别表示 hERG 基因所表 达的滞 留 于 内 质 网 内 的 不 成 熟 核 心 糖 基 化 蛋 白 （ 135kD 蛋 白 质 条 带 ） 和 位 于 细 胞 膜 上、完全成熟的糖基化蛋白（ 155kD 蛋 白 质 条 带 ） ， 表明 hERG-U2OS 稳定表 达细胞株 构建成 功。 分子生物 学相关 实验 结果如下 ：1. RT-PCR 结果显 示： miR-134、miR-143、 miR-103、miR-3619 过表达可使 hERG 相关 mRNA 相对 表达量 较对照组 下调 ； 用 相 应 的 AMOs 拮抗 miRNAs ， hERG 相关 mRNA 相对 表 达 量 较对照组 无 明 显 变 化 ； miR- 147、 miR-185 作 用 下 hERG 相关 mRNA 相对表达量 较对照组 无明显改 变；I2. Western blot 结 果显 示：miR-134、miR-143、miR-103、miR-3619 过 表达可使 hERG 相关 蛋 白 质 表达 较 对 照 组 下 调 ； 用 相 应 的 AMOs 拮抗 miRNAs ， hERG 相关 蛋 白 质 表 达 较 对 照 组 无 明 显 变 化 ； miR-147 、 miR- 185 作用 下 hERG 相 关蛋白质 表达较 对照 组无明显 改变；3. 激 光 共 聚 焦 结 果 显 示 ： miR-134 、 143 、 103 、 3619 过 表 达 可 使 hERG- U2OS 细 胞 胞 质 内 未 成 熟 蛋 白 及 细 胞 膜 上 成 熟 通 道 蛋 白 的 表 达 较对照组 均 降低，用 相应 的 AMOs 沉默 miRNAs，hERG 相 关蛋白 质表达 较对照组 无 明显变化 ；而 miR-147、185 作用 后，hERG-U2OS 细胞胞 内及 胞膜上蛋 白 质表达较 对照组 均无 明显变化 。结论： 本 实 验 进 一 步 验 证 了 hERG 基因 是 miR-134、 143、 103、 3619 的 靶 基 因 ， 证 实 它 们 可 使 WT-hERG 基因 编码的 m